GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA:
SPERMATIDI
Contenuto in DNA durante la spermatogenesi
Classificazione degli spermatidi
(Vanderzwalmen et al, 1997)
• spermatide maturo: spermatozoo con connessioni con le
cellule del Sertoli
• spermatidi “elongated”: coda ben evidente, di lunghezza
variabile
• spermatide “elongating”: coda visibile come protrusione
laterale
• spermatide rotondo: cellula rotonda, con diametro di 7-8
micron, abbozzo dell’acrosoma visibile come uno spot
chiaro o scuro, o come protrusione
Indicazioni
Azoospermia secretiva dovuta a:
• ipospermatogenesi
• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatocita
di I ordine
• arresto maturativo allo stadio di spermatide rotondo
• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatogone
• forme miste (Sertoli cell only syndrome “incompleta” e
arresto maturativo)
ICSI con precursori degli spermatozoi
• ELSI (Fishel et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di
spermatidi allungati da cellule con un abbozzo di coda fino
alle forme più mature con differenziazione completa ma
unite alle cellule di Sertoli
• ROSI (Tesarik et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di
spermatidi rotondi con o senza abbozzo del cappuccio
acrosomiale
• ROSNI (Sofikitis et al, 1997): iniezione intracitoplasmatica
del solo nucleo di spermatidi rotondi
Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) e di nuclei di
spermatidi rotondi (ROSNI): fase sperimentale
Autore
specie
tecnica
risultato
Ogura et al,
1993
Ogura et al,
1994
Sofikitis et al,
1994
Kimura e
Yanagimachi, 1995
hamster
ROSNI+ES
embrioni
fattore
maschile
no
topo
ROSI+ES
prole
no
coniglio
ROSNI
prole
no
topo
ROSNI
prole
no
Sofikitis et al,
coniglio
ROSNI+ES
prole
no
1996
Goto et al, 1996
bovino
ROSI
blastocisti
no
Sofikitis et al,1996
coniglio
ROSNI+ES
no gravidanze
varicocele
Sasagawa e
Yanagimachi,1997
topo
ROSI
prole
criptorchidismo
Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (1)
Autore
tecnica
gravidanze
cliniche
aborti
nati
Hannay et al,1995
ROSNI
4
4
0
Tesarik et al, 1995
ROSI- eiaculato
2
0
2
Fishel et al, 1995
ELSI elongated
1
0
1
Mansour et al, 1996
ROSI
1
0
1
Tanaka et al, 1996
ROSI
1
1
0
Araki et al, 1997
ELSI elongated
3
0
4
Vanderzwalmen
et al, 1997
ELSI elongated/
elongating
3
0
3
Vanderzwalmen
et al, 1997
ROSI
1
0
1
Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (2)
Autore
tecnica
gravidanze
cliniche
3
aborti
nati
Sofikitis et al, 1997
ROSNI
0
3
Amer et al, 1997
ELSI elongated/
elongating
2
0
?
Sofikitis et 1998
ELSI elongated
2
0
2
Sofikitis et al, 1998
nucleo di
1
spermatocita di II ordine
0
1
Kaharaman et al,1998
ELSI
2
1
2
Kaharaman et al,1998
ROSI
1
1
0
Barak et al, 1998
ROSI-eiaculato
1
0
1
Barros et al, 1998
ELSI
3
0
1
AL-Hasani et al,1999
ELSI
2
0
0
Aspetti di laboratorio
ROSI
ELSI
cicli
108
60
oociti iniettati
648
475
2 PN (%)
274 (31)
277 (58)
gravidanze cliniche
11 (11)
16 (18)
nati
10
13
% impianto
6.5
6.1
Problematiche di laboratorio
• identificazione della cellula
• attivazione dell’oocita
• timing dei 2 pronuclei
• sviluppo embrionale
Identificazione degli spermatidi rotondi
• TEM
• visualizzazione selettiva dell’acrosina o della proacrosina
con anticorpi monoclonali
• FISH per la valutazione dell’aneuploidia
• Papanicolau
• Testsimplet
• microscopio cofocale
• microscopio con ottica Hoffman
• microscopio con contrasto di fase
Spermatide rotondo:
criteri per l’identificazione a fresco
• cellula rotonda con diametro di 6.5-8 micron (cellule più
piccole)
• nucleo rotondo, centrale
• contorno liscio
• citoplasma uniformemente distribuito
• protusione laterale o spot a diversa densità ottica addossato
al nucleo
• vitalità: resistenza all’aspirazione nella micropipetta
Problematiche di laboratorio
fertilizzazione dell’oocita
• materiale genetico (DNA + nucleoproteine)
• asincronia maturativa
• fattore attivante l’oocita
• centrosoma
zigote e singamia
• comparsa dei 2 PN a 8-9 ore dall’iniezione
• singamia con presenza di 1 nucleo a 16-18 ore
Metodiche per la preparazione
• separazione meccanica con aghi o vetrini
• digestione enzimatica:
– collagenasi
– collagenasi + elastasi
– tripsina + DNAsi
Rischi potenziali
legati alla tecnica
• aumentato rischio di mosaicismo per anomalie del
centrosoma
• aumentato rischio di iniettare materiale diploide
• anomalie dell’imprinting
legati alla patologia sottostante
• mutazioni genetiche legate alla sterilità
• anomalie numeriche e traslocazioni
• AZF: AZFa (Sertoli cell-only), AZFb (arresto maturativo),
AZFc (Sertoli cell-only “incompleta)
Coltura in vitro di spermatidi
(Fishel et al, 1998)
sopravvivenza
• 50% a 48 ore
• 0% a 96 ore
maturazione
• 8 % con crescita completa del flagello a + 4 ore
• 22 % con crescita completa del flagello da +8 ore