Lezione 9-10
martedì 12 Marzo 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
Clonaggi classici e PCR
rinfrescando le idee ed i ricordi
Amplificazione del DNA tramite clonaggio
Un vettore è una molecola di DNA che può replicare
autonomamente in una cellula batterica o di lievito, dalla quale
può essere successivamente isolato e purificato.
Frammenti di DNA, digeriti (tagliati) mediante enzimi di
restrizione, possono essere inseriti nei vettori: tale processo è
detto clonaggio.
L’enzima DNA ligasi provvede poi alla formazione del legame
fosfodiesterico alle estremità inserto-vettore e quindi alla chiusura
della molecola circolare.
Esempio Eco-RI
Steacky ends for cloning with Eco-RI site
Inserimento di DNA esogeno
La trasformazione é un processo che avviene nei batteri e
comporta l'inserimento di DNA esogeno in vari modi
La trasfezione é l'inserimento di DNA esogeno in cellule
eucariotiche.
si potrebbe sostenere che il primo è più naturale, benchè
esistano esempi di trasferimento orizzontale di materiale
genetico anche negli eucarioti sia nei vegetali (rhizobium)
ma anche in mammiferi-rettili (vipera-vacca)
Bov-B long interspersed repeat in vipera
Bov-B long interspersed repeated DNA (LINE) sequences are
present in Vipera ammodytes phospholipase A, genes and in
genomes of Viperidae snakes.
European J. Biochemistry 246, 772-779 (1997)
DuSan KORDIS and Franc GUBENSEKﾕ.ﾕ ﾕ Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Joief Stefan Institute,
Ljubljana, Slovenia Faculty of Chemistry and Chemical
Technology, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia
Eredità orizzontale
Sequences and structural organization of phospholipase A2
genes from Vipera aspis aspis, V. aspis zinnikeri and Vipera
berus berus venom. Identification of the origin of a new
viper population based on ammodytin I1 heterogeneity.
Eur J Biochem. 2003 Jul;270(13):2697-706
Guillemin I, Bouchier C, Garrigues T, Wisner A, Choumet V.
Unité des Venins, Institut Pasteur, Paris, France.
Dai serpenti “squamati” ai bovini
Horizontal transfer of non-LTR retrotransposons in vertebrates.
Kordis D, Gubensek F.
Genetica. 1999;107(1-3):121-8.
Since their discovery in family Bovidae (bovids), Bov-B LINEs, believed to be order-specific
SINEs, have been found in all ruminants and recently also in Viperidae snakes. The distribution
and the evolutionary relationships of Bov-B LINEs provide an indication of their origin and
evolutionary dynamics in different species. The evolutionary origin of Bov-B LINE elements has
been shown unequivocally to be in Squamata (squamates). The horizontal transfer of Bov-B
LINE elements in vertebrates has been confirmed by their discontinuous phylogenetic
distribution in Squamata (Serpentes and two lizard infra-orders) as well as in Ruminantia, by
the high level of nucleotide identity, and by their phylogenetic relationships. The direction of
horizontal transfer from Squamata to the ancestor of Ruminantia is evident from the genetic
distances and discontinuous phylogenetic distribution of Bov-B LINE elements. The ancestral
snake lineage (Boidae) has been recognized as a possible donor of Bov-B LINE elements to
Ruminantia. The timing of horizontal transfer has been estimated from the distribution of Bov-B
LINE elements in Ruminantia and the fossil data of Ruminantia to be 40-50 mya. The
phylogenetic relationships of Bov-B LINE elements from the various Squamata species agrees
with that of the species phylogeny, suggesting that Bov-B LINE elements have been stably
maintained by vertical transmission since the origin of Squamata in the Mesozoic era.
esempio di applicazione biotecnolgica
Oltre al trasferimento di geni tra le specie è anche
possibile "eliminare" caratteristiche non volute
come la produzione di determinate proteine
(tecnologia antisenso).
ES: Questa tecnica é stata utilizzata per eliminare il gene che
faceva ammorbidire il pomodoro creando un prodotto con
migliori qualità di conservazione, (ma più difficili da masticare
e digerire).
Applicazioni biotecnologiche
dell’ingegneria genetica
• isolamento e analisi di geni
• produzione di proteine di interesse in cellule (studi di interazione e
di pathways, produzione o alterazioni di siti attivi, produzione per
vaccini ecc.)
• costruzione di cellule o virus con nuove proprietà
• modificazione del corredo genetico di organismi superiori
TRASFEZIONE II
Metodo ideale:
alta efficienza di trasferimento del materiale
genetico
bassa tossicità per le cellule
riproducibilità in esperimenti
Perché si trasfetta
Applicazioni
•Studio di struttura e funzione di geni
•Studio dei meccanismi di regolazione
dell'espressione genica
•Produzione di proteine su larga scala
•Produzione di modelli animali per ricerca
•Terapia genica
Barriere da superare
DNA e membrana cellulare sono carichi negativamente: il DNA,
per forze di repulsione elettrostatiche, quindi, non interagirà
spontaneamente con la membrana.
Molti metodi di trasfezione servono per mascherare i gruppi
anionici del DNA.
Metodi -Chimici : Lipidi cationici
-Fisici: polarizzazione membrane con
“pulse” inpulsi di corrente continua
schema di trasfezione
Metodi Chimici:
-Precipitazione con
fosfato di Ca++
-DEAE-Destrano
DEAE destrano
-Polimero cationico che si lega strettamente ai gruppi
fosfato del DNA carichi negativamente.
• Queste grosse particelle contenenti il DNA aderiscono
alla superficie delle cellule e vengono introdotte al
loro interno mediante un processo di endocitosi.
• Metodo tecnicamente semplice, ma poco efficiente per
molti tipi cellulari,
Fosfato di Calcio
Metodo semplice e poco costoso.
La procedura prevede il mescolamento di:
• una soluzione contenente ioni fosfato
• una soluzione di cloruro di calcio (CaCl2)
• il DNA da trasfettare
Si produce un precipitato di calcio fosfato, che andrà a legare la
molecola di DNA.
Il precipitato viene prelevato e aggiunto al terreno di coltura (di
solito una coltura monostrato).
Con un processo ancora non ben noto le cellule legano il
precipitato e permettono l'ingresso del DNA.
Elettroporazione e iniezione
Metodi Fisici:
1. Elettroporazione
2. Microiniezione
difficile trovare lo
zigote se non si ottiene
in vitro da oocita e
spermatozoi, altrimenti
si usa la blastocisti
Elettroporazione
Le cellule, poste in una soluzione
contenente il DNA, sono
sottoposte ad un breve impulso
elettrico che produce
pori transitori nella membrana
attraverso cui il DNA esogeno
può entrare.
Svantaggio: alta % di cellule che non sopravvivono al
trattamento.
microiniezione per animali transgenici
Inserimento del materiale direttamente nel nucleo o nel
citoplasma nella cellula tramite un sottile ago
montato su uno specifico microiniettore.
Nonostante l’elevata efficienza, tale metodo non viene utilizzato
spesso a causa dei costi non indifferenti dell’apparato, delle
difficoltà tecniche e della lentezza.
Più frequentemente usato in clinica, in tecniche come la
fecondazione artificiale; in laboratorio dove si lavora con un alto
numero di cellule ES si preferisce elettroporazione.
metodo chimico
Lipidi cationici:
Metodo che sfrutta i
liposomi, piccole vescicole
lipidiche che inglobano il
DNA ed entrano nella
cellula mediante endocitosi.
Lipidi cationici
La testa cationica del composto lipidico si associa strettamente
con la carica negativa dei gruppi fosfato degli acidi nucleici.
I complessi
lipidi/DNA o RNA
si associano per
poi fondersi con le
membrane
cellulari, e
vengono così
internalizzati
nella cellula.
3D trasfezione cationi
Lipidi cationici:
schema lipidi
Metodica vantaggiosa :
• il DNA viene rilasciato efficientemente in diversi tipi cellulari
• i liposomi sono semplici da utilizzare in quanto non richiedono apparati o
accorgimenti particolari
Parametri di trasfezione
Parametri da considerare: diversità tra metodo chimico ed elettrico
CHIMICO:
•DNA trasfettato (deve essere privo di contaminazioni da
proteine, da RNA), funziona sulle cariche anioniche
•Tempo di trasfezione (il tempo ottimale è un parametro
dipendente da tipo di DNA e linea cellulare utilizzati
(caratteristiche di membrana, e può variare da 30 minuti a 4
ore)
•Effetti del siero (ottimizzata in assenza di siero ed antibiotici
nel terreno di coltura)
•Tipo di vettore (Ogni costrutto mostra caratteri distintivi
propri che lo rendono adatto per specifici prodotti
sperimentali.)
Trasfezione transiente o stabile
Transiente quando il vettore resta nella cellula come frammento
extracromosico, cioè non si integra nel genoma cellulare; le
proprietà indotte dalla trasfezione permangono per breve tempo,
di solito scompaiono prima delle 72 ore (misurazioni su 3 max. 6
giorni) si deve anche lasciare il tempo al vettore che si esprima, si
usa un enzima marcatore come luciferasi o lac-z per avere
l’efficienza di trasfezione. A ogni mitosi raddoppiano le cellule e
si dimezza la quantità di DNA trasfettato in rapporto alle cellule.
Il DNA trasfettato non si duplica.
Stabile quando il DNA esogeno si integra stabilmente nel genoma
e sarà trasmesso anche alle cellule che ne derivano, il vettore si
duplica con il genoma cellulare.
transiente
Il DNA verrà mantenuto nel citoplasma per un determinato periodo
di tempo, in genere 2-3 giorni fino ad una settimana se è lenta la
divisione cellulare.
Il DNA non integrato, non è duplicato con il materiale cromosomico
della cellula ospite e poi ripartito in meiosi, manca di origine di
replicazione e di centromero.
(trasfezione transiente).
Solo in pochi casi, verrà integrato nel genoma cellulare ed il vettore
verrà preparato per la ricombinazione random o sito specifica
(trasfezione stabile).
L’isolamento di queste cellule e della loro progenie richiede la
selezione con un gene marcatore presente nel DNA esogeno, che
consente alle cellule trasformate di crescere in un terreno selettivo,
di solito un antibiotico.
Inserzione stabile
Cambiano i tipi di vettori oltre alla tecnica di trasfezione
Pregi e difetti:
- transiente si vede rapidamente, ma non si può vedere due
volte con lo stesso materiale, va rifatta la trasfezione. Ci
vogliono buoni controlli e un plasmide che si cotrasfetta
come maratore dell’efficienza di trasfezione, di solito lac-z o
luciferasi. A volte si può avere un unico costrutto anche con
il marcatore.
- stabile ha bisogno anche di più di una settimana per avere
ben espressa la resistenza all’antibiotico e poi si devono
fare altri controlli sull’integrazione ed integrità del costrutto
integrato
tecniche di trasfezione simili
Comunque sia il tipo di vettore, la tecnica di trasfezione è
analoga, tranne che per i fagi ed i virus che hanno la loro
via per iniettare il DNA nelle cellule ospite tramite
recettori o analoghi modi ad alta efficienza di fusione del
capside (proteico o lipoproteico) senza grande danno per
la cellula
vetori virali analizzati a parte
La struttura del vettore dal punto di vista genomico non è
diverso dagli altri vettori per la struttura delle parti che
devono specificare la sua funzione nella cellula ospite.
la differenza sta nel capside con cui viene veicolato per
ottenere alta efficienza di trasfezione “pseudo-infezione”
molti vettori che vengono trasfettati con metodologie
chimiche o fisiche hanno delle parti che possono derivare da
virus o fagi e però non essere impacchettati o prodotti come
particelle virali, viceversa alcuni vettori possono essere
impacchettati in particelle virali senza contenere gran parte
del genoma virale, mediante helper-virus