Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio le regioni regolative non ci sono molti esempi già studiati il primo classico è quella del locus della globina una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico a livelli superiori mancano degli esempi più chiari potrebbero mancare oppure sono da scoprire regioni regolative con funzione bidirezionale per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico questo tipo di controllo può essere bidirezionale: TOP - DOWN BOTTOM - UP esempio del cluster delle Ig la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari “ extracellulari intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine partiamo da un esempio un sistema piuttosto noto ed interessante la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo sistema multifattoriale esempio di interazione genoma ambiente the study of the 3’RR TOR VERGATA different aspects of the study of a regulatory region interactions of a regulatory region: unidirectional flux ? the jerarchy of the regulation the genome is controlled by epigenetic events interactions of genome and environment these events open the possibility of a non univocal flux needs to be bidirectional TOR VERGATA interactions and jerarchy epigenetic modifications of the region: nucleosome remodeling; methylation tools for a RR study TOR VERGATA the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human) “La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni” La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80% Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia (a parte le memory cells che sono minoranza) - processi di maturazione ed interazioni - cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa - processo evolutivo - instabilità e regioni duplicate - nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata - l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico - studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate - studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA cascata di fosfatasi e kinasi nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali CD45 Rap 1 MAPKs prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR Locus Catene leggere D-J processing V-DJ VDJ processing riarrangiato VDJ riarrangiato VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD CELLULE B Locus Catene pesanti V-J processing ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE maturazione Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B. Locus Catene leggere CELLULE B Locus Catene pesanti VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. Centrociti Cellule Memoria Plasmacellule Plasmacellule Cellule B attivate ANTIGENE DIPENDENTE VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato DIFFERENZAZIONE FINALE maturazione II Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B. induzione dello switch PLASMACELLULE Cellule B proliferanti IgG2a o IgG3 Cellula B attivata (centroblasto) IgA o IgG2b IL-2; IL-4; IL-5; IgE o IgG1 Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-; IL-2; IL-4; IL-5; cellule denditriche e T-helper Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) IgM ricombinazione VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J V(D)J m d g3 g1 2b e a • Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Ricombinazione class switching (CSR) IgM V(D)J e 2a Switch region: m a 2a d IgE Risultato dello switch 2b g3 • Il filamento non stampo è ricco in G g1 Circolo exciso Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo. • Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. mappe dei loci IgH e IgL LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l Cromosoma 22 Locus catena leggera k Cromosoma 2 Locus catena pesante Cromosoma 14 il riarrangiamento Trascrizione regione S A 1 CSR ricombinasi? A B C D E F 2 AID? Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili RNA editing ? Riconoscimento delle regioni S accessibili B C AID? CSR ricombinasi? A B Formazione di strutture secondarie (R loop?) D C A F B Formazione di breaks al DNA E AID? una regione S S A B C Delezioni intra-switch Riparazione dei breaks C A AID? due regioni S D F E Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA B Switch su un altro cromosoma S S A B E F Class switching recombination A S c-myc traslocazione Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). Activation-induced cytidine deaminase (AID) C espressione nelle fasi di sviluppo Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43, TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19 pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT, riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cell receptor, riarrangiamento produttivo della catena leggera espressione di membrana di IgM Trascrizione dei surrogati delle catene leggere m Ig a/ formano il pre-B cell receptor complex di membrana essenziale per le fasi di sviluppo (CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante) CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico maturazione nel germinal center avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo : -proliferazione clonale -ipermutazioni somatiche -selezione di affinità (self ed altro) -selezione negativa -switch isotipico strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH promotori dei geni V enhancer intronico iEm ECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes 3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. region k intronico iEk 3’kE l light chain El si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico Cluster organization: evoluzione delle Ig Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj IgM IgNAR IgW IgM1gj (V DDJ Cm)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10(VD J Cm1gj)<10 (multiple chromosomes)(not L chain-associated) Translocon organization: Channel catfish (700 - 800kb) Cm 9J’s many V’s VDJ D,J’s 100-200 V’sD’s teleostei Cm Cdsec Cdmem IgM lungfish several V’s D, J’s Cm dipnoi several V’s D, J’s C Presumptive arrangement IgM coelacanths Cm VD’s(>100) J’s Xenopus (~800 kb) IgW VD’s(>100) J’s IgM V’s(100-200) D(>15) J(8-9) Sm Cm crossopterigi (latimera) C IgY IgX S C ?S C 48 kb (duck); 80kb (chicken) Duch and chicken pseudoV’s(~100) Cattle V D’s J Sm Cm C a Sa S C Transcriptional orientation 150 kb (cattle) J(2) E 7 geni costanti V’s(~15) D(>3) Sm Cm Sd Cd Sg3 Cg3Sg1 Cg1Sg2 Cg2 Se Ce Sa Ca Rabbit J(6) V’s(~100) D(14) Sm Cm Sg Cg Se Ce Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca Sa Ca J(4) Mouse forse 13 geni costanti E 200 kb E V’s(~100) D(14) Sm Cm Cd J(6) Human 13 Ca genes E V’s(~100) D(27) Sm Cm Cd S Cg3 S Cg1 S Cg2b S Cg2a S Ce S Ca E 8 geni costanti 350 kb S Cg3 S Cg1 S e S Ca1 E S Cg2 S Cg4 S Ce S Ca2 E 10 geni costanti cluster Ig topo-uomo centromero a e mta1 crip2 crip1 hole Mouse Igh cluster Chromosome 12 telomero g2a g2b g1 g3 d m trascrizione mta1 J DV Em J D V 12F1 BAC199M11(AF450245) a2 e mta1 crip2 crip1 hole Human Igh cluster Chromosome 14 (rischio riarrangiamenti) g4 g2 g a1 e g1 g3 d m Em mta1 J D V 14q32.33 IgH3’RR-A J DV 3’a2 g elk 2.1 3’a1 hs4 hs1.2 hs3 20bp a1 3’a1 86,035,000 IgH3’RR-B 86,040,000 86,050,000 86,055,000 elk 2.2 hole 85,894,500 86,045,000 85,904,500 85,914,500 85,924,500 86,060,000 86,065,000 86,070,000 hs4 hs1.2 85,934,500 85,944,500 86,075,000 hs3 20bp a2 85,954,500 3’a2