CITOGENETICA
CONVENZIONALE
E
MOLECOLARE
CITOGENETICA CONVENZIONALE
La citogenetica convenzionale è una tecnica
che permette lo studio del numero e della
struttura dei cromosomi (studio del cariotipo)
I cromosomi vengono esaminati “bloccati” in
metafase.
Step:
•prelievo del campione (SP, BM o tessuto linf.)
•allestimento delle colture cellulari
•allestimento dei preparati
•bandeggio dei cromosomi
Allestimento delle colture e dei preparati
Tecniche di
coltura
Allestimento
preparati
•Diretta: terreno di coltura+colchicina
4-6 ore
•Medio termine: terreno + colchicina
24-48 ore
•Sincronizzata: blocco in fase S (MTX)
rimozione del blocco
colchicina
•post-incubazione: centrifugazione
•soluzione ipotonica per distensione
dei cromosomi
•centrifugazione → fissativo (alcol metilico o
acido acetico)
Tecniche di bandeggio dei cromosomi
Tecniche generali
(intero cromosoma)
Bandeggio Q
Bandeggio G
Bandeggio R
BANDEGGIO
STATICO
Tecniche speciali
(porzioni cromosoma)
Bandeggio C
Bandeggio Cd (fuso)
Bandeggio NOR geni
RNA ribosomi
BANDEGGIO
DINAMICO
Informazioni sul tipo di replica di
ogni cromosoma durante la fase S
(uso raro in onco-ematologia)
Bandeggio Q
•mostarda di
chinacrina
(intercala tra copppie di
basi)
•contrasto tra
bande: scarso
• non colora
telomeri
•colora
eterocromatina
Bandeggio R
•soluzione salina
+ Giemsa
•complementari
a bande Q e G
(soluzione salina)
•contrasto < a
bandeggio G
•colora telomeri
eucromatina
•colora poco
eterocromatina
Cromosomi normali
Cromosoma
metacentrico
Cromosoma
submetacentrico
Cromosoma
acrocentrico
Cariotipo normale
46 cromosomi
(n. diploide)
22 coppie (omologhi)
autosomi (1-22)
2 cromosomi sessuali
XY (M) e XX (F)
Anomalie cromosomiche
Anomalie del numero
Anomalie strutturali
•quasi aploidi (n +/-)
•ipodiploidi (2n-)
•iperdiploidi (2n+)
•pseudodiploidi
•monosomie
•trisomie
•traslocazioni (reciproche e non)
•delezioni (intersiziali o terminali)
•duplicazioni
•inversioni
Traslocazioni
T (2;15) (p11.2;q11.2)
bilanciata
T (13;14) (p11.2;p11.2)
sbilanciata
Delezioni cromosomiche
Del (7)
(q11.23 q21.2)
delezione
interstiziale
braccio lungo (q)
cromosoma 7
CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH)
La Fluorescent In Situ Hybridization
(FISH) è una tecnologia che utilizza
sonde nucleotidiche marcate (DNA
probes) per identificare specifiche
regioni di un cromosoma ovvero
determinate sequenze del DNA.
Step:
•denaturazione del DNA
•incubazione sonda + DNA denaturato
(“annealing”)
•rilevazione del segnale della sonda
con microscopio a fluorescenza
Tipi di sonde (DNA probe)
Nucleotidi + biotina o digossigenina
(fluorocromo + streptavidina)
(fluorocromo + Ac anti-digossigenina)
Sonde
nucleotidi coniugati a fluorocromi
Sonde
•Alfoidi: per sequenze ripetitive dei satelliti
(anomalie numeriche)
•Painting: specifiche per un cromosoma
(cromosomi molto riarrangiati)
•Locus singolo: sequenze specifiche DNA
(es. geni di fusione)
FISH: tappe della metodica
Campioni DNA:
cromosomi in
metafase
o
nuclei in
interfase
FISH in interfase
FISH in
metafase
probe per parte
terminale del cr.
4q
FISH: vantaggi e limiti
Vantaggi
Limiti
•Esamina elevato n. di cellule in tempi brevi
•Metodica semplice
•Elevata efficienza di ibridizzazione
•Elevata sensibilità e specificità
•Non necessità cellule in mitosi
•Correla dato citogenetico con morfologico
•Informazioni su singolo cromosoma/gene
•Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio
•Soglia di positività da calcolare per ogni sonda
•Possibili artefatti nell’analisi di inclusi
in paraffina
Citogenetica nelle leucemie acute
Classificazione delle leucemie acute
(entità cliniche all’interno di un citotipo FAB)
Definizione del rischio citogenetico
(significato prognostico)
Monitoraggio della malattia minima residua:
sensibilità citogenetica convenzionale <
sensibilità FISH
TECNICHE DI
BIOLOGIA MOLECOLARE
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Tecnica che si basa sulla capacità di una DNA polimerasi
di amplificare in modo esponenziale una regione di DNA a
sequenza sconosciuta (templato) posta tra due porzioni di
DNA a sequenza nota.
Step:
•Estrazione di DNA (o RNA)
•Cicli di amplificazione:
denaturazione
“annealing”
estensione dei primers
•Analisi degli amplificati
PCR: estrazione di DNA (o RNA)
DNA
Proteinasi + fenolo-cloroformio-alcool
isoamilico
time: 2 giorni
RNA
Guanidio isotiocianato + mercaptoetanolo
cloroformio ( a 4 °C)
time: 2 giorni
DNA/RNA
Concentrazione
Qualità
KIT commerciali/ strumenti per automazione
260 nm (DNA)
spettrofotometria
280 nm (proteine)
A 260
A 280
PCR: cicli di amplificazione
Miscela di amplificazione
•DNA templato
•DNA polimerasi termostabile
•Buffer di reazione (TrisHCl e KCl)
•Ione magnesio
•Desossinucleotidi trifosfato
•Primers: brevi sequenze di DNA a singolo
complementari a sequenze note
poste a monte e a valle del templato
PCR: cicli di amplificazione
Denaturazione
(~ 1 min 95°C)
Raffreddamento e
“annealing” dei primers
(~ 1 min 45-60°C)
Estensione dei primers
da DNA polimerasi
(~ 1 min 72°C)
PCR: cicli di amplificazione
Cicli ripetuti 25-45 volte
Amplificazione:
crescita esponenziale ed efficienza di reazione
Xn = X0 x (1 + Ex)n
Efficienza della
reazione
Qualità e concentrazione del DNA/RNA
Qualità e concentrazione del cDNA
Concentrazione dei vari reagenti
Condizioni di temperatura della
reazione
Numero di cicli
plateau
PCR qualitativa: analisi dei risultati
Elettroforesi in gel di agarosio
Corsa: 1/2 ora a 150 V
Colorazione con etidio bromuro
UV transilluminazione
Fotografia
7.5 nM
5 nM
0 nM
ddH2O
7.5 nM
30
ddH2O
0
5
Bortezomib [nM]
7.5
Ang2
GAPDH
100
80
60
40
20
0
Fig. 4
Roccaro et al.
Interior area (pixel)
Interior area (pixel)
Ang1
GAPDH
150
100
50
0
neg ctrl
0
5
Bortezomib [nM]
7.5
neg ctrl
0
5
Bortezomib [nM]
7.5
7.5 nM
neg ctrl
5 nM
7.5
7.5 nM
5 nM
0 nM
0
5
Bortezomib [nM]
0 nM
0
neg ctrl
ddH2O
0
ddH2O
50
120
90
60
7.5 nM
100
GAPDH
150
5 nM
GAPDH
150
0 nM
Interior area (pixel)
IL-6
IGF-1
Interior area (pixel)
5 nM
0 nM
ddH2O
Interior area (pixel)
VEGF
GAPDH
180
120
60
0
neg ctrl
0
5
Bortezomib [nM]
7.5
PCR qualitativa: vantaggi e limiti
Vantaggi
Limiti
•Elevata sensibilità
•Elevata specificità
•Identificazione di traslocazioni non dimostrate dalla
citogenetica
•Possibilità di analisi simultanea delle traslocazioni più
frequenti
•Possibilità dell’esecuzione dell’analisi da campioni bioptici
•Possibilità di contaminazioni
•Efficienza di amplificazione variabile e dipendente
da vari fattori
•Impossibilità di stabilire la q di sequenza bersaglio
•Presente all’inizio nel campione
PCR quantitativa real-time
Thermal-cycler (amplificazione)
Sistema ottico per rilievo della
fluorescenza
Software per raccolta ed analisi
dei dati
Analisi dei prodotti non alla fine
della reazione, ma durante la
fase di crescita lineare delle
molecole di amplificato
Real-time PCR: metodo Taqman
Sonda specifica per target
Q = fluorocromo quencher
(rosso, onda lunga)
R = fluorocromo reporter
(verde, onda corta)
Sonda Taqman si lega a
DNA target
I primer si legano a 3’ e 5’
del DNA templato
Real-time PCR: metodo Taqman
Real-time PCR: metodo Taqman
Real-time PCR: metodo Taqman
PCR quantitativa: vantaggi e limiti
Vantaggi
Limiti
Velocità
Sensibilità (10-4 – 10-6)
Specificità
Standards
commutabilità
confrontabilità
accuratezza
Variabilità nella determinazione quantitativa
Complessità sperimentale
Mancanza di standards
Valutazione critica dei risultati
TECNOLOGIA DEI
MICROARRAY E
LEUCEMIE ACUTE
DNA-microarray
Metodica che consente di analizzare il profilo di espressione genica
delle cellule.
Procedura di base:
•Sequenze di DNA sono schierate in ordine su supporto solido.
•Dal campione viene estratto mRNA e retrotrascritto in cDNA.
•cDNA, marcato con tracciante fluorescente, ibridizza con sequenze
su array.
•Il livello di espressione di un gene è direttamente proporzionale
all’intensità di segnale derivato dalle immagini digitali acquisite.
Principali tipi di microarray: 1. membrane based cDNA microarray
2. glass slide-based cDNA microarrays
3. oligonucleotide microarray o
DNA chip
DNA-microarray e leucemie acute: possibili sviluppi
Riclassificare le leucemie
Individuare profili di espressione genica in relazione alla prognosi
Individuare profili di espressione genica in relazione a vie di
trasduzione del segnale per definire terapie molecolari target
Individuare profili di espressione genica in relazione alla sensibilità
o resistenza ad un dato farmaco