Microarray Data Analysis
Letizia Magnoni
Junior Scientist
Sienabiotech Spa
Letizia Magnoni
Bioinformatics and statistics in drug discovery company
Argomenti
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Cosa e’ un esperimento di microarray
A cosa serve
Come si puo’ disegnare un esperimento
Normalizzazione
Analisi
Analisi Cluster
Annotazioni dei geni selezionati
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Gene expression
• Ogni cellula contiene una copia completa del genoma
dell’organismo.
• Esistono vari tipi e stati di cellule (cellule di sangue, nervi
e pelle, cellule che si dividono, cellule cancerogene, ecc.)
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Variazione dell’espressione
• Cosa rende le cellule diverse tra loro?
• L’espressione differente dei geni, cioe’
quando, dove e quanto ogni gene e’
espresso.
• In media, il 40% dei nostri geni e’ espresso
in ogni momento.
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mRNA
cDNA
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Perche’ Microarrays
• In passato solo analisi di un gene (o pochi)
alla volta (Northern blot)
• Oggi fino a 40.000 geni su una sola
microarray.
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Applicazioni di Microarrays
• Individuazione di target per farmaci e validazione
– identificazione di geni modulati in modo specifico rispetto ad una
certa malattia (differential expression)
• Elicidazione dei meccanismi dell’azione
– Drug safety profiling
– Guilt by association (geni con comportamento connesso tra loro)
– Pathway modeling
• Classificazione di nuovi composti
• Diagnostica
• Identificazione di Biomarkers
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“Disegno” di un esperimento
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Insieme dei trattamenti selezionati per il
confronto
La specificazione delle unita’ a cui
verranno somministrati i trattamenti
Le regole secondo cui i trattamenti
vengono assegnati ad ogni unita’
sperimentale
La specificazione delle misurazioni (R/G)
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Disegno Sperimentale
• Fonti di variazione:
– Variazione biologica
– Variazione tecnica
– Variazione dovuta alla
collocazione degli
elementi nelle arrays.
G. A. Churchill in Nature Genetics vol. 32, 2002
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Vari Disegni Sperimentali
• Dye-swap:
A
B
A
B
A1
B1
A2
B2
• Dye-swap ripetuto:
• Dye-swap con replica biologica:
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Vari Disegni Sperimentali
• Reference:
A
N.B. Questo disegno
sperimentale non mette in
luce la variabilita’ introdotta
dalla colorazione.
Ref
A mix B
B
• Per migliorare questo disegno:
N.B. Meta’ delle misurazioni
vengono fatte nel campione di
minore interesse.
A
Ref
A mix B
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B
Vari Disegni Sperimentali
• Loop:
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A1
B1
B2
A2
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Trattamenti:
Replicati:
Colorazioni:
A
B
A1
A2
B1
B2
RNA1
GR
RNA2
GR
RNA3
GR
RNA4
GR
Arrays:
Disegno:
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A1
B1
B2
A2
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Trattamenti:
Replicati:
Colorazioni:
A
B
A1
A2
B1
B2
RNA1
GR
RNA2
GR
RNA3
GR
RNA4
GR
Arrays:
Disegno:
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A1
B1
A2
B2
Normalizzazione
• Si vuole togliere dai dati tutta quella
variabilita’ che non ha origine biologica:
– Campioni (isolamento, estrazione di RNA,..)
– Probe nature (cDNA clones, oligos, ..)
– Arrays (substrato, lotto, difetti di superficie, ..)
– Colorazione (colore, attivita’ specifica, ..)
– Ibridizzazione (tempo, temperatura)
– Misurazione (hardware, software, saturation)
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Normalizzazione
• Possibili approcci:
– Housekeeping genes set (which genes, mean
value)
– Complete gene set (min./selected/all,
fluorescence intensity)
– Spiked exogeneous control mRNAs (mean
value)
– Linear regression analysis
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Tecniche di normalizzazione
• Normalizzazione dell’intensita’ totale
– Questo tipo di normalizzazione assume una
uguale quantita’ di mRNA per entrambi i
campioni etichettati.
– Si cerca una costante “c” che aggiusti i dati in
modo tale che i due campioni abbiano media
o mediana uguale.
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Normalizzazione dell’intensita’ totale
Ai  log 2 Ri  Gi
 Ri 
M i  log 2  
 Gi 
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La trasformazione degli assi
coordinati ci permette di
visualizzare meglio i dati
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Tecniche di Normalizzazione
• Tecniche di Regressione:
– Regressione lineare dei dati e successiva
normalizzazione in modo tale che il
coefficiente lineare della retta di regressione
abbia coefficiente angolare unitario.
– Regressione lineare locale (LOWESS)
“LOcally WEighted Scatter plot Smooth”
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Normalizzazione con tecniche di regressione locale
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Analisi Statistica dei dati
• Si vuole rispondere alle domande:
– La differenza che vedo nei miei dati e’
significativa?
– Le differenze osservate sono dovute solo alla
diversa risposta dei campioni ai trattamenti?
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T-test con due campioni:
confronto tra le due medie
• Ipotesi:
– I campioni hanno distribuzioni normali;
– I campioni sono originati da due variabili
indipendenti;
– Due possibili assunzioni sulle varianze:
se  12   2 2 o altrimenti.
La statistica test ha una
distribuzione t di Student
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Confronto tra medie di due
campioni in un esperimento di Microarray
• Si vogliono evitare tutte le assunzioni fatte
precedentemente.
• Statistica test (Welch Statistic); per ogni gene i
calcoliamo:
ti 
x 2i  x1i
s22i s12i

n2 n1
• Per determinarne la distribuzione possiamo utilizzare
algoritmi di permutazione o di bootstrap.
B. Efron, R. J. Tibshirani: “An Introduction to the Bootstrap”, Chapman & Hall (1993)
S. Dudoit et al: “Statistical methods for identifying differentially expressed genes in
replicated cDNA Microarray Experiments”, Statistica Sinica 12(2002), pp 111-139
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Permutation test
– Stima la distribuzione della statistica test sotto
l’ipotesi nulla (che non ci sia differenza tra i
due campioni) tramite permutazioni dei
campioni etichettati.
– Il p_value p g e’ dato come frazione delle
permutazioni per cui il valore della statistica
test e’ (almeno) tanto estremo quanto quello
che e’ stato osservato.
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Multiple testing
• Supponiamo di avere un esperimento con
10.000 geni e decidiamo di controllare
l’errore di tipo I al 5% (rifiuto l’ipotesi nulla
quando il p-value e’ minore di 0.05):
– il valore atteso di rigettare in modo errato
l’ipotesi nulla sara’: 10.000 x 0.05 = 500.
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Multiple testing methods
• Dobbiamo considerare il fatto di dovere
aggiustare il livello di significativita’ del nostro
test (multiple testing procedure)
– Bonferroni (non e’ consigliabile per
esperimenti di microarrays)
– Westfall and Young step-down procedure
– False Discovery Rates (FDR; Benjamini and
Hochberg, 1995)
Dudoit et al, “Multiple Hypothesis Testing in Microarray Experiments”, U.C. Berkeley
Division of Biostatistics Working Paper Series, 2002
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Modelli ANOVA
• Questi modelli cercano di dare una stima delle
piu’ importanti fonti di variabilita’ presenti in un
esperimento.
–
–
–
–
Arrays (Ai)
Dyes (colorazione) (Dj)
Varieties (trattamenti) (Vk)
Genes (Gg)
i = 1,2,..,#arrays
j = 1,2
k = 1,2,..,#varieties
g = 1,2,..,#genes
Il modello che si assume e’:
log( yijkg )    Ai  D j  Vk  Gg  ( AG)ig  (VG)kg  ( DG) jg  ijkg
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Modelli ANOVA e disegno sperimentale
• Disegno Dye-Swap
A
B
log( yijkg )    Ai  D j  Vk  Gg  ( AG)ig  (VG)kg  ijkg
• Disegno reference
A
Ref
B
log( yijkg )    Ai  Vk  Gg  (VG)kg  ijkg
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Analisi da un punto di vista Bayesiano
• Entrambe le tecniche presentate hanno un
approccio mediante la statistica Bayesiana.
– P. Baldi,”A Bayesian framework for the analysis of
microarray expression data: regularized t-test and
statistical inferences of gene changes”,
Bioinformatics, Vol.17, no 6, pp 509-519 (2001)
– D.A.Henderson, “Bayesian Statistical Methods for the
Detection of Differential Gene Expression and Control
of Multiple Hypothesis Testing in cDNA and
Oligonucleotide Microarray Experiments”, University
of Arizona
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Siti interessanti
http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/Group/index.html
http://www.jax.org/staff/churchill/labsite/research/index.html
http://www.gene-chips.com/
http://www.nslij-genetics.org/microarray/analy.html
http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html
http://www.bioconductor.org/
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html
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Grazie
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