La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina
richiede la possibilità di:
1. Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine
del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla
base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO
ENZIMATICO)
2. Misurare la quantità di proteine totali nel campione
3. Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse
proteine Enzima
totali
(mg)
(mg)
Omogenato
1000
100
Resa
%
Purezza
(%)
U totali
As
(U/mg)
100%
10%
10000
10
1° stadio
purificazione
5000
2° stadio
purificazione
2500
3° stadio
purificazione
1980
Saggio
colorimetrico
Resa =
As
=
Stima da SDS-PAGE
Saggio di attività Valore ipotetico proteina
enzimatica
pura = 100 U/mg
mg o U di prot. di interesse nella frazione
mg o U di prot. di interesse all’inizio della purificazione
U di proteina di interesse nella frazione
mg di protine totali nella frazione
Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche
sotto l’influenza di un campo elettrico
Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili
e, quindi, ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione
come specie elettricamente cariche
Sotto l’influenza di un campo elettrico queste molecole cariche
migrano verso il catodo o l’anodo, a seconda che possiedano una
carica positiva (cationi) o negativa (anioni)
L’elettroforesi è dunque il processo per cui molecole cariche si separano
in un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilità
I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico
comprendono la carica della molecola (q), il gradiente di voltaggio del
campo elettrico (E), la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f)
Il prodotto dei parametri q ed E (q x E) fornisce la forza, misurata in
newton, che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica
opposta
La forza frizionale f, la quale rallenta il movimento della molecola carica,
dipende dalle dimensioni della molecola, dalla sua forma, dalle
dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene l’elettroforesi e dalla
viscosità del tampone
La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico
è data dunque dalla seguente equazione:
v
Eq
f
Comunemente è adoperato il termine mobilità elettroforetica (μ) dello
ione, che equivale alla velocità dello ione diviso l’intensità del campo
elettrico (v/E)
Quando si applica una differenza di potenziale, molecole con carica
elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loro
mobilità elettroforetica
Anche molecole con carica elettrica uguale, ma con dimensioni
molecolari differenti, si separeranno per effetto di forze frizionali
diverse
Se il campo elettrico è rimosso prima che le varie molecole cariche
abbiano raggiunto gli elettrodi, si ha una separazione dei singoli
componenti in base alla loro mobilità elettroforetica
Una volta terminata la separazione dei campioni, questi sono
visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione
Elettroforesi
catodo
anodo
-
+
- +
+ +
-
Velocità di
migrazione
+
Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA
Inversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARI
Elettroforesi
-
+
- +
+ +
-
Velocità di
migrazione
+
Direttamente proporzionale al rapporto
CARICA / MASSA
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
+
+
+
+
+
+
+
-
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
+
+
+
+
+
+
+
-
Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazione
delle molecole che devono essere separate
Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico
viene annullato le proteine restano nel punto che
avevano raggiunto
Aggiunta del Fissativo
Gli studi pionieristici sull’elettroforesi furono condotti in soluzione libera
Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodica,
in particolar modo gli effetti negativi della diffusione, potevano essere
limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene l’elettroforesi
Ciò fu realizzato facendo avvenire l’elettroforesi su un supporto
meccanico poroso, il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone
di corsa ed all’interno del quale si realizzava l’elettroforesi degli ioni del
tampone e del campione
Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di
impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il
mezzo di supporto), privo di carica e stabile in un ampio intervallo
di temperatura, pH e osmolarità e dovrebbe avere una porosità
controllata e regolabile in modo preciso
Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gel
di poliacrilammide o di agarosio
Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importanti
perché contribuiscono al coefficiente di attrito (f)
L’effetto di setaccio del mezzo di supporto, insieme al
rapporto carica/massa delle molecole, contribuisce a
determinare la separazione delle molecole del campione
COMPONENTI PRINCIPALI
Alimentatore
Cella elettroforetica
1. Per elettroforesi su gel verticale
2. Per elettroforesi su gel orizzontale
Se durante una elettroforesi è applicato un voltaggio costante,
l’intensità di corrente, per effetto della diminuzione della
resistenza, aumenta, determinando un aumento del calore
sviluppato (si veda la legge di Ohm: V/I=R).
Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire
una corrente costante. In questo modo si eliminano le
fluttuazioni di calore.
Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso
dal loro punto isoelettrico (pI)
Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso
l’elettrodo di carica opposta
Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nell’intervallo 3-10 e la
maggioranza di esse ha un pI<8
Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle
proteine ha una carica netta negativa e migrerà in un campo elettrico
verso l’anodo (elettrodo positivo)
La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecole
proteiche è l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio
dodecil solfato (SDS-PAGE)
La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo
elettrico si basa essenzialmente sull’effetto setaccio
L’SDS-PAGE consente la separazione di molecole con un
rapporto carica/massa identico, ma di dimensioni
molecolari diverse
Nell’SDS-PAGE la matrice del gel è una sostanza reticolata
che agisce come un setaccio, in cui le forze di attrito fanno
diminuire la mobilità elettroforetica delle molecole in
relazione alle loro dimensioni
Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni
dell’elettroforesi di proteine e di molte applicazioni dell’elettroforesi di
acidi nucleici
L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel
La porosità del gel di poliacrilammide può essere regolata variando la
percentuale di acrilammide e/o il grado di legami trasversali tra le
catene di acrilammide
L’acrilammide allo stato liquido è una potente neurotossina.
Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni
che prevedono l’utilizzo di acrilammide.
Quando pesate o utilizzate la polvere, indossate una maschera.
Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima
di essere eliminate.
Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con
tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente
apposito per rifiuti tossici.
Una volta polimerizzata l’acrilammide perde tossicità.
I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare
monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di
N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide).
La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide
legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado
di formare legami crociati (cross-linking agent).
I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e
occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide.
In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per
l’estensione. Ciò fa sì che si formi una matrice con dei legami
crociati a struttura ben definita.
Acrilammide
Bis-acrilammide
Il processo di polimerizzazione dell’acrilammide è un tipico esempio
di catalisi radicalica ed inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato e
della base N,N,N’,N’-tetrametilendiammina (TEMED).
Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la
produzione del corrispondente radicale libero (cioè una molecola
con un elettrone spaiato), nel modo seguente:
L’ammonio persolfato
è l’estere disolfato
dell’acqua ossigenata e
omolisa rapidamente a
radicali instabili
(radicali solforici).
Il TEMED è un’ammina
terziaria che reagisce
con questi radicali a
formare radicali liberi
TEMED, che a loro volta
reagiscono con
l’acrilammide inducendone
la polimerizzazione.
TEMED (iniziatore)
Se rappresentiamo il radicale libero con R· ed il monomero di
acrilammide con M, possiamo schematizzare la polimerizzazione nel
modo seguente:
R· + M → RM·
RM· + M → RMM·
RMM· + M → RMMM· ecc.
In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute
insieme tra loro da legami crociati derivanti dall’inserzione
occasionale all’interno della catena di molecole di bis-acrilammide.
Dal momento che l’ossigeno rimuove i radicali liberi dalla
soluzione, tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono
degassate prima dell’uso. Le soluzioni sono poste in beute da
vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare
l’ossigeno disciolto.
Acrilammide
bis-acrilammide
(catalizzatore)
TEMED (iniziatore)
GEL DI POLIACRILAMMIDE
(molto idrofilico =>
trattiene grosse quantità di acqua)
E’ un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammide.
In questo caso al posto dell’ammonio persolfato e del TEMED si utilizza
riboflavina.
La soluzione è illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa.
La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali
liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel.
Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essere
controllate variando la quantità di monomero (acrilammide) o aumentando
il grado di legami trasversali per ottenere pori più stretti.
In genere il grado di legami trasversali è mantenuto costante, mentre si
varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porosità.
Per un gel di una data composizione si avrà una distribuzione statistica di
dimensioni dei pori.
Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento
minimo, mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori sarà
ritardata.
In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un
particolare ambito di dimensioni
Percentuale di
acrilammide
Ambito ottimale di
dimensioni
molecolari (Da)
5-12
20.000-150.000
10-15
10.000-80.000
>15
<15.000
N.B.: la percentuale di bis-acrilammide è fissa e corrisponde a circa il 5%
dell’acrilammide.
Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo
che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle
catene polipeptidiche.
Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil
Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si
ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS.
In media, ogni due amminoacidi sarà presente una molecola di SDS.
Poiché ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH
adoperati per l’elettroforesi, la carica netta delle catene polipeptidiche
rivestite sarà molto più negativa di quella delle catene non rivestite.
Inoltre il rapporto carica/massa sarà essenzialmente identico per
proteine diverse, dal momento che il rivestimento di SDS domina la
carica.
La separazione delle catene polipeptidiche
denaturate e rivestite di detergente
si baserà quasi esclusivamente
sulle dimensioni delle molecole proteiche
Sodio Dodecil Solfato
CH3(CH2)10CH2OSO3- Na+
proteina
 Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è
essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli
 La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è
versata direttamente al di sopra del resolving gel
 Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle
proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel
 In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving
gel in maniera efficace e riproducibile
 Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di
acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare un’alta porosità, ed è
tamponato con tampone Tris-HCl a pH 6,8
 Il resolving gel contiene invece una percentuale
acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a pH 8,8
più alta di
 Il tampone di corsa contiene Tris a pH 8,3 con glicina come controione
Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stacking gel a pH 6,8 sarà principalmente
nella sua forma zwitterionica neutra, con una piccola frazione (1%) in forma di ione
glicinato carico negativamente
Ciò impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente
Gli ioni Cl- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 6,8 e migrano rapidamente
verso l’anodo
Durante questa elettroforesi nello stacking gel, la concentrazione degli ioni Cl- scende
drasticamente all’estremità catodica del gel, formando un gradiente crescente di
concentrazione verso l’anodo
Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante, i quali hanno rapporti carica/massa
maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl-, devono adesso migrare per
portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl- e davanti alla glicina
A mano a mano che procede l’elettroforesi, le molecole proteiche che raggiungono il
resolving gel sono ritardate notevolmente, consentendo alle molecole proteiche che le
seguono di raggiungerle
Il volume del campione di proteine “presentato” al gel di risoluzione sarà molto più piccolo
del volume caricato inizialmente sullo stacking gel
Quando viene applicata la corrente, tutte le specie ioniche presenti devono
migrare alla stessa velocità altrimenti si verifica una interruzione nel circuito
elettrico.
Perché ciò avvenga è necessario che gli ioni glicinato, più lenti, siano soggetti
ad un campo elettrico più intenso rispetto agli ioni Cl- più veloci.
Il campo elettrico è inversamente proporzionale alla conduttività, la quale a
sua volta è proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente.
Il risultato è che le tre specie ioniche tendono a variare la propria
concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano più concentrati dei complessi
SDS-proteina, i quali, a loro volta, siano più concentrati del glicinato.
Dal momento che la quantità di complessi SDS-proteina è molto inferiore alla
quantità di ioni glicinato, questi complessi tendono a concentrarsi in una
banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-.
•
Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del pH più alto
(6,8 nello stacking gel e 8,8 nel resolving gel), diviene completamente ionizzato
e quindi aumenta la propria mobilità
•
Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl- migrano più
velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina, i quali migrano in maniera
inversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari
•
La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di
setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel
•
Le proteine più piccole passano più facilmente all’interno dei pori del gel, mentre
le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali