corso di Genomica a.a. 2010-2011
lezione 25-26
• laurea magistrale Biotecnologia
Industriale
Martedì 11 Gennaio 2011
aula 6A
orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo
D. Frezza
Espressione x staminalità
4 geni di staminalità Oct 3/4 (Pouf 5f1), Sox2, c-myc, Klf4
Fibroblasti trasfettati e selezionati per espressione di Fbxo15
cellule iPS = induced pluripotent (Fbx15iPS)
Fenotipo come ES, proliferano e danno teratomi;
Diverse per l’espressione del DNA e metilazione, non
producono topi chimerici adulti iniettandole in blastocisti
Nuovo esperimento: selezione delle iPS per l’espressione di
Nanog
Espressione di Nanog
Produzione di fenotipo germline-competent iPS
aumento di espressione: di geni ES-cell-like e del pattern di
metilazione rispetto alle Fbx15 iPS
I 4 transgeni Oct3/4, Sox2, c-myc e Klf4 sono silenziati nei
cloni di cellule Nanog iPS
Sono stati ottenuti topi chimerici da 7 cloni Nanog iPS ed un
clone è stato trasmesso nella generazione successiva di un
topo transgenico
Circa il 20% dei topi transgenici sviluppava tumori per la
riattivazione di c-myc
riattivazione di c-myc
c-myc transgenico genera rischio neoplastico nel 20% della
progenie dei topi transgenici
Cellule iPS competenti per avere topi chimerici “germline” e
poi transgenici possono essere ottenute da fibroblasti
Deve essere evitato l’uso della transgenesi c-myc per le
applicazioni cliniche.
Il marker Nanog
Mitsui K, Yamanaka S. et al.
Embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass (ICM) of
blastocysts grow infinitely while maintaining pluripotency. Leukemia
inhibitory factor (LIF) can maintain self-renewal of mouse ES cells
through activation of Stat3. However, LIF/Stat3 is dispensable for
maintenance of ICM and human ES cells, suggesting that the pathway is
not fundamental for pluripotency. In search of a critical factor(s) that
underlies pluripotency in both ICM and ES cells, we performed in silico
differential display and identified several genes specifically expressed in
mouse ES cells and preimplantation embryos. We found that one of
them, encoding the homeoprotein Nanog, was capable of maintaining ES
cell self-renewal independently of LIF/Stat3. nanog-deficient ICM failed to
generate epiblast and only produced parietal endoderm-like cells. nanogdeficient ES cells lost pluripotency and differentiated into extraembryonic
endoderm lineage. These data demonstrate that Nanog is a critical factor
underlying pluripotency in both ICM and ES cells.
Cell. 2003 May 30;113(5):631-42
Nanog sono LIF indipendenti
Cellule LIF Stat 3 proliferano ma è dispensabile,
Differential display experiments in silico hanno mostrato che
l’omeogene Nanog mantiene la totipotenza
-formazione della massa interna della blastocisti e staminalità
- efficienza della riprogrammazione dopo fusione con cellule
somatiche
Nanog promotes transfer of pluripotency
after cell fusion Nature 2006 Jun 22;441:997-1001
Silva J, Chambers I, Pollard S, Smith A.
Through cell fusion, embryonic stem (ES) cells can erase the developmental
programming of differentiated cell nuclei and impose pluripotency. Molecules that
mediate this conversion should be identifiable in ES cells. One candidate is the
variant homeodomain protein Nanog, which has the capacity to entrain (~indurre)
undifferentiated ES cell propagation. Here we report that in fusions between ES
cells and neural stem (NS) cells, increased levels of Nanog stimulate pluripotent
gene activation from the somatic cell genome and enable an up to 200-fold
increase in the recovery of hybrid colonies, all of which show ES cell
characteristics. Nanog also improves hybrid yield when thymocytes or fibroblasts
are fused to ES cells; however, fewer colonies are obtained than from ES x NS
cell fusions, consistent with a hierarchical susceptibility to reprogramming among
somatic cell types. Notably, for NS x ES cell fusions elevated Nanog enables
primary hybrids to develop into ES cell colonies with identical frequency to
homotypic ES x ES fusion products. This means that in hybrids, increased Nanog
is sufficient for the NS cell epigenome to be reset completely to a state of
pluripotency. We conclude that Nanog can orchestrate ES cell machinery to
instate pluripotency with an efficiency of up to 100% depending on the
differentiation status of the somatic cell.
Selezione per Nanog cells
Prova di selezione delle cellule che esprimono Nanog
(omeogene) per ottenere cellule iPS (ind. pluripotent stem)
- Isolamento di un Bac (bacterial artificial chromosome) ~200kb
contenente Nanog
- inserimento in ES di GFP, IRES-puromycin resistence gene
cassette nel 5’UTR
- cellule con l’espressione di GFP non inducibili al
differenziamento
- si ottengono topi chimerici GFP (+Nanog-IRES-Puror)
- GFP si mantiene nella massa interna della blastocisti e solo in
Primordial Germ Cells che migrano
- dopo 13.5 gdc GFP nelle creste genitali-germinali
Isolamento di fibroblasti
-Isolamento di fibroblasti embrionali (MEF) da cellule delle
creste genitali, cervello e tessuti viscerali
- solo 1% delle creste genitali esprime GFP vedi figura
Figura 1 ES
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trasformazione di una linea
SNL fibroblast feeder layers support derivation and
maintenance of human induced pluripotent stem cells.Pan C,
Hicks A, Guan X, Chen H, Bishop CE.
College of Animal Science and Technology, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology
for Agriculture, Northwest A & F University, Yangling 712100, China.
Abstract
Induced pluripotent stem (iPS) cells can be derived from human somatic cells by
cellular reprogramming. This technology provides a potential source of noncontroversial therapeutic cells for tissue repair, drug discovery, and opportunities
for studying the molecular basis of human disease. Normally, mouse embryonic
fibroblasts (MEFs) are used as feeder layers in the initial derivation of iPS lines.
The purpose of this study was to determine whether SNL fibroblasts can be used
to support the growth of human iPS cells reprogrammed from somatic cells using
lentiviral expressed reprogramming factors. In our study, iPS cells expressed
common pluripotency markers, displayed human embryonic stem cells (hESCs)
morphology and unmethylated promoters of NANOG and OCT4. These data
demonstrate that SNL feeder cells can support the derivation and maintenance of
human iPS cells.
J Genet Genomics. 2010 Apr;37(4):241-8.
trasformazione con retrovirus
Fibroblasti Nanog-GFP-IRES-Puror MEFs coltivate su feeder
SNL (Neo G418 resistente)
-trasformazione con retrovirus con Oct3/4, Sox2, Klf4 ed il
mutante di c-myc (T58A)
- selezione per la resistenza alla puromicina dopo 3, 5, 7
giorni dalla infezione col retrovirus
- si ottengono più cellule GFP aumentando la conc di purom.
-trasformazione con combinazioni di 3 geni su 4 non erano
sufficienti a dare cellule GFP
- trapianto sottocutaneo di queste cellule produceva tumori di
tessuti diversi derivati dai tre foglietti: dimostrazione della
totipotenza