Cosa sono gli enzimi di restrizione
Sono enzimi che tagliano la doppia elica del
DNA in corrispondenza di specifiche
sequenze. Per questo motivo vengono anche
detti endonucleasi di restrizione (invece le
esonucleasi distruggono il DNA partendo
dalle estremità). Ne esistono molti tipi
diversi, ognuno dei quali riconosce una
sequenza particolare.
Gli enzimi di restrizione proteggono i batteri
dall’introduzione di molecole di DNA esogeno
Batteriofagi
Batterio
ceppo A
Batterio vivo
Batterio
ceppo B
Batterio lisato
-Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il
DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica.
-Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il
SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze
palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi).
Hae III
5’ GGCC 3’
3’ CCGG 5’
Eco RI
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Not I
5’ GCGGCCGC 3’
3’ CGCCGGCG 5’
Enzimi
Il taglio con gli
enzimididirestrizione
restrizione può
generare diversi tipi di estremità.
Eco RI= 5’ protruding
-GAATTC-G3’
-CTTAAG-CTTAA5’
Eco RV= blunt
-GATATC-CTATAG-
-GAT3’
-CTA5’
Pst I= 3’ protruding
-CTGCAG-CTGCA3’
-GACGTC-G5’
5’AATTC3’G-
5’ATC3’TAG-
5’G3’ACGTC-
QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE?
La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi se
assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole
di DNA:
-per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA
un taglio ogni 256 nucleotidi (4x4x4x4).
-per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN
MEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (46).
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
Cella elettroforetica per gel di agarosio
Il DNA digeritoEnzimi
con gli di
enzimi
di restrizione
restrizione
può essere analizzato mediante elettroforesi
Plasmide (P)
M
Eco RI (E)
10 kb
Bam HI (B)
Eco RI
DNA genomico (G)
3x 109 basi
P
P+B P+E G+E
-
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
+
MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA
6.6 bp
M
PstI
HindIII
PstI+HindIII
-
4.1
4
3
2.6
2.3
2
2.3
1.7
1.4
1.4
1.2
1.1
1.1
1
0.6
0,5
PstI HindIII
1.1 kb
0.6 kb
2.3 kb
+
HindIII PstI
1.2 kb
1.4 kb
Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione,
consentendo di tagliare il DNA in
frammenti non casuali, la cui
grandezza dipende unicamente
dalla sequenza, costituiscono un
formidabile strumento sia per
l’analisi che per la
manipolazione del DNA.
Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare
covalentemente due molecole di DNA adiacenti
con estremità libere
DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO
UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA
LIGASI
CLONAGGIO
-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN
INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO
GENETICAMENTE IDENTICI
-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA
OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA
DI PARTENZA
Il clonaggio del DNA
• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA
ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e
introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace
di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene
introdotta in un sistema cellulare appropriato (in
genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta
clone, conterranno la medesima molecola di DNA
ricombinante originariamente isolata, permettendo
di produrne quantita’ praticamente illimitate
Plasmidi
• Molecole extracromosomiali di DNA circolare,
capaci di replicarsi e di segregare autonomamente
rispetto al DNA cromosomale dei batteri.
• Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai
batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni
ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.)
• Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che
non sia troppo grande)
• Possono essere facilmente purificati dal DNA
cromosomale in grande quantità.
Plasmidi
Plasmidi: Superavvolgimento
M
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sono
adiacenti, vengono uniti in provetta.
Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la
tecnica del DNA ricombinante.
I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di
restrizione.
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
Le estremità coesive prodotte da uno stesso
enzima possono appaiarsi.
G
CTTAA
AATTC
G
GAATTC
CTTAAG
Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare
covalentemente le due molecole di DNA
OH
OH
P
5’
G AATTC
CTTAA G
5’
3’
P
3’
P
G AATTC
CTTAA G
OH
P
3’
5’
OH
OH P
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
P
3’
5’
OH
DNA LIGASI
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
ATP
3’
5’
Solo estremità compatibili possono essere
legate efficientemente
INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO
IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
CLONAGGIO:
- LIGASI
- TRASFORMAZIONE
- SELEZIONE
- CRESCITA COLONIE
IDENTIFICAZIONE
DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
Cosa può succedere in una reazione ligasica ?
1. Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto
2. Il vettore si lega con l’inserto
L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare
le colonie che contengono un plasmide con inserto da quelle che
contengono un plasmide senza inserto
ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTE
DA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLA
COMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE.
SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NON
SI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO.
CCC/GGG
GGG/CCC
GAT/ATC
CTA/TAG
EcoRV
SmaI
CCC ATC
GGG TAG
LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEI
DUE ENZIMI.
QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI????
E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT
Estremita’ 5’ protruding:
5’
3’
3’
5’
L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI.
Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli
(DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica).
Estremità 5’ o 3’ protruding:
5’
3’
3’
5’
Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.
Il fago lambda come vettore di clonaggio
Il ciclo vitale
del fago lambda
Placche di lisi
Lisogenia
Replicazione ‘rolling circle’
COS
Genoma
COS
Genoma
Packaging
COS
Genoma COS
Il fago lambda come vettore
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YAC