Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo
Studio del ruolo funzionale e
caratterizzazione strutturale del
cuprocomplesso TFF1-Cu
Tutor:
Prof. Liberato Marzullo
Dottorando:
26/01/2012
Sandro Montefusco
Introduzione:
Famiglia dei Trefoil Factors
Costituita da: peptide gastrico pS2/TFF1,
peptide
spasmolitico
SP/TFF2
e
fattore
intestinale ITF/TFF3
Struttura
- Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato
da tre ponti disolfuro
Funzione
- Ruolo essenziale nei processi di restituzione e
rigenerazione epiteliale nel tratto GI
- Coinvolgimento
in cruciali processi fisiopatologici: insorgenza e sviluppo neoplastico,
proliferazione,
differenziamento,
migrazione
cellulare, apoptosi
Introduzione:
Lacrimal Glands
Hypothalamus –
Hypophysis
Siti di espressione:
TFF1: stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole
di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali,
epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari.
TFF2: stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto
pancreatico e biliare.
TFF3: epitelio intestinale, cellule goblet,
ghiandole
Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi.
Bladder
Introduzione:
Infiammazione
Variazioni dei livelli dei peptidi TFF
sembrano essere coinvolte nei
processi neoplastici
Ulcere intestinali, soggetti affetti dal
morbo di Crohn e infezioni da H.
pylori presentano, nelle aree
compromesse, elevati livelli di TFF1
Tumor-suppressor
TFF1 ridotto in metaplasie intestinali e
adenomi gastrici, TFF1 completamente
assente nel 40-60% di carcinomi gastrici
Topi tff1 knockout
sviluppano adenoma gastrico e
carcinoma intramucosale
Carcinoma della mammella
TFF1 indotto da estrogeni
TFF1 marker tumorale
Trefoil Factor 1
TffTime
1 tff1
Real
L’analisi effettuata su intestino di ratti,
resi nutrizionalmente carenti di rame, ha
mostrato aumento dell’espressione del
peptide TFF1.
fold induction
8
6
4
2
0
1
controllo Cu D
TFF1 lega specificamente il rame.
L ’ interazione induce un cambio di
conformazione nella struttura terziaria
della proteina.
Obiettivi:
- Valutare l ’ espressione di TFF1 in condizioni di
depletamento di rame.
- Studiare l ’ influenza del rame sull ’ attività
biologica della proteina.
- Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di
omeostasi del rame.
- Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle
infezioni da Helicobacter pylori.
Espressione di TFF1 in cellule AGS
Real Time PCR
** p value = 0,08 * p value < 0,05
L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni
di depletamento di rame
Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi
Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi
1
controllo
-435
BCS
0
5
10
15
anova p<0,05
Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni
di concentrazione del metallo che regolano positivamente
l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame
Analisi del promotore
L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha
mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze
consensus con score più elevato
Analisi del promotore
sonda: p Sp1
p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1
m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame
c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1
Scr: sequenza scrambled
sonda: c Sp1
Analisi del promotore
sonda: p Sp1
p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1
m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame
c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1
Scr: sequenza scrambled
sonda: c Sp1
Le proteine degli estratti nucleari
legano in modo specifico la
sequenza putativa di legame ad Sp1
Obiettivi:
- Valutare l ’ espressione di TFF1 in condizioni di
depletamento di rame.
- Studiare l ’ influenza del rame sull ’ attività
biologica della proteina.
- Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di
omeostasi del rame.
- Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle
infezioni da Helicobacter pylori.
Rame e forma omodimerica di TFF1
Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC1
TFF1
condizioni riducenti
TFF1
dimero
condizioni non riducenti
Il rame promuove la formazione dell’omodimero
Migrazione Cellulare: Wound Healing
AGS-AC1
QuickTime™ e un
decompressore DV - PAL
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Migrazione Cellulare: Wound Healing
BCS
24 h
+ dox
- dox
+ dox
*
- dox
distance
distanza (m)
(µm)
* p-value < 0,05
AGS-AC1
TFF1
* p-value < 0,05
(Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S,
D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC,
Marzullo L., Cell Mol Life Sci. 2010)
L’induzione di TFF1 determina un aumento della migrazione cellulare
La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF1
Obiettivi:
- Valutare l ’ espressione di TFF1 in condizioni di
depletamento di rame.
- Studiare l ’ influenza del rame nella
formazione dell ’ omodimero di TFF1 e sulla
sua attività motogenica.
- Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di
omeostasi del rame.
- Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle
infezioni da Helicobacter pylori.
Rame e secrezione di TFF1 in AGS-AC1
Controllo
Cu 10 M
Cu 100 M
72 h
controllo
Cu 10 μM
Cu 100 μM
In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un
ritardo nella secrezione della proteina
TFF1 e omeostasi del rame
0,45
0,40
0,35
mg/gr
0,30
+/+
-/-
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Fegato
KO tff1
AGS-AC1
1
Stomaco
Intestino
TFF1 e omeostasi del rame
24 h -S
+/- dox
0 20 80
AGS-AC1
Cu 10 M
300
Cellule iper-esprimenti
TFF1 accumulano quantità
maggiori di rame
TFF1 e omeostasi del rame
24 h -S
Cu 10 M
+/- dox
0 20 80 120
AGS-AC1
BCS 500 M
300
Cellule iper-esprimenti
TFF1 trattengono il rame
per tempi più lunghi
600
TFF1 e omeostasi del rame
Bassi livelli di rame
Alti livelli di rame
TFF1
Cu2+
Obiettivi:
- Valutare l ’ espressione di TFF1 in condizioni di
depletamento di rame.
- Studiare l ’ influenza del rame sull ’ attività
biologica della proteina.
- Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di
omeostasi del rame.
- Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle
infezioni da Helicobacter pylori.
Helicobacter pylori: interazione con TFF1
H. pylori interagisce con TFF1
Ipotesi per l ’ infezione tessutospecifica caratteristica del batterio
La porzione oligosaccaridica degli
LPS di H. pylori legano TFF1 nella
forma dimerica
Il pH ottimale di questa interazione
è tra 5.0 - 6.0
Helicobacter pylori: introduzione
1892 - Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima
volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali.
1893, Arch Mickrobiol Anat
1984 - Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero
per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi,
dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme
di gastrite attiva e ulcere duodenali
1984, Lancet; 8390:1311-5
1989 - Classificazione del genere Helicobacter
Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39:397
2005 - I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la
medicina
Helicobacter pylori: introduzione
•
Gram Negativo
•
Dimensioni: 0,5-1 m x 2-4 m
•
Microaerofilo: 37°C 3-5 giorni
•
Mobile per la presenza di 4-6 flagelli
•
Genoma: 1,4 - 1,7 Mb
•
Patogeno per l’uomo
•
Ureasi positivo
•
Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale
•
Epidemiologia: endemica
paesi industrializzati
paesi in via di sviluppo
adulti
bambini
>50 anni
2-10 anni
35-40%
80-90%
5-10%
45-50%
Helicobacter pylori: fattori di virulenza
Cag island:
locus ~ 40 kb, 31 geni.
Molti di questi geni codificano per il sistema di
secrezione di tipo IV.
Cag Island
CagA:
proteina batterica che transloca
nella
cellula
ospite
promuovendo
cambiamenti morfologici e alterazioni della
membrana plasmatica.
Suerbaum S. & Josenhans C., Nature 2007
Effects of VacA
VacA:
altera la permeabilità della
membrana
mitocondriale
promuovendo
l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori;
altera il normale traffico delle vescicole del
compartimento endosomiale provocando la
formazione di canale e formazioni di vacuoli.
BabA2:
lega l ’ antigene Lewis(b) delle
cellule epiteliali gastriche.
Cover T.L.. & Blanke S.R.., Nature 2005
Helicobacter pylori: LPS
-Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori
-Particolari variazioni nella componente “Lipide A”
-Infezioni a lungo termine
-Infiammazione cronica promuove un danno gastrico
Helicobacter pylori: LPS
Lisati Cellulari
Frazioni Subcellulari
LPS
Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione
Effetti dei
trattamenti sulla
vitalità di H. pylori
Cu 10 µM
BCS 500 µM
Dox
Helicobacter pylori: Infezione di H. pylori in AGS-AC1
AGS-AC1
rosso - H. pylori
verde - TFF1
blu - nuclei
Controllo
CagA
+ Dox
130 kDa
Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione
Infezioni con ceppo H. pylori P12 wild-type
Hp
Cu
Dox
-
Cu 10 M
BCS 500 M
Hp
+
-
+
+
+
BCS
Dox
-
+
-
+
+
+
T-test : p-value **< 0,01 * <0,05
TFF1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori
Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1
Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione
Il ceppo mutato
P12HP∆1191 non
Wt P12
interagisce con TFF1
P12HP479
P12HP1191
(Dolan B. et al.,
dati confidenziali, in stampa)
HP479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase
HP1191 codifica una LD heptosyltransferase
Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione
Infezioni con ceppo mutato HP479
Cu 10 M
BCS 500 M
Cu
Dox
-
+
+
+
BCS
Dox
-
+
+
+
T-test : p-value **< 0,01 * <0,05
Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione
Infezioni con ceppo mutato HP1191
Cu control
Dox
-
Dox
+
+ Cu
Dox
+
Helicobacter pylori: interazione con TFF1
HT29 MTX E12 (E12):
Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano,
caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.
(Alemka A., et al., Infect Immun. 2010)
TFF1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso
(Dolan et al., dati confidenziali, in stampa)
Helicobacter pylori: interazione con TFF1
Infezioni in HT-29 E12 con ceppo H. pylori P12 wild-type
Cu 10 M
BCS 500 M
T-test : p-value * <0,05
Rame e strato mucoso
HT29 MTX E12 (E12):
Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano,
caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.
(Alemka A., et al., Infect Immun. 2010)
Rame e strato mucoso
controllo
A
B
D
E
C
F
Rame e strato mucoso
controllo
Cu
Risultati
• Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di
tff1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di
concentrazione del metallo.
• Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF1 e la sua attività
motogenica.
• TFF1, nel modello cellulare AGS-AC1, è coinvolto nei processi
di assorbimento/secrezione del metallo.
• TFF1 favorisce l ’ infezione di H. pylori. Il rame modula
positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1.
Prospettive future
• Verificare l’effettivo legame di Sp1 sul promotore di TFF1.
• Approfondire il coinvolgimento di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del
rame.
• Individuare la regione di TFF1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.
Ringraziamenti
Università di Salerno
Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche
Prof. Liberato Marzullo
Prof. Alessandra Tosco
Dr. Marguerite Clyne
University College Dublin
School of Medicine & Medical
Science
Dr. M.-C. Rio
Dr. Bianca Fontanella
Dr. Roberta Esposito
Institute of Genetics and Molecular
and Cellular Biology - CNRS.
Strasbourg, France
Dr. D. Baldantoni
Dipartimento di Chimica - Università di
Salerno
Coordinatrice del Dottorato
Prof. Antonella Leone
Considero valore sapere in una stanza dov’è il
nord,
qual è il nome del vento che sta asciugando il
bucato.