Trasporti attraverso
la membrana
Proteine di trasporto
Una membrana costituita da un puro bilayer
fosfolipidico è impermeabile alle proteine e alla
maggior parte delle piccole molecole
Gas
Piccole
molecole polari
non cariche
Etanolo
Acqua
Urea
Grosse
molecole polari
non cariche
Glucosio
Ioni
Molecole
polari
cariche
Aminoacidi
ATP
Glc-6-P
Proteine di trasporto
2 principali classi di proteine di trasporto:
Proteine Carrier
Proteine Canale
soluto
ione
bilayer
lipidico
sito di legame del soluto
poro acquoso
Diffusione Facilitata
Caratteristiche dei trasporti mediati
• I carriers sono dotati di specificità
• Sono soggetti a saturazione
• Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi
• Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH
I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi
• I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi
• Legano selettivamente il loro substrato, cioè la
molecola che deve essere trasportata
• Cambiano di conformazione per rilasciare il
substrato dall’altro lato
• Ritornano alla conformazione originale per legare
un’altra molecola di substrato
• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten
Analisi cinetica del transporto di una molecola
tramite proteina carrier: saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono
liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione
Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un
flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers
20
300
15
F=kdDC
200
F
F
2
Flusso netto [moli/(cm s]
Fmax
10
100
F max
ka
1
C
I flussi mediati da carriers a differenza della diffusione
libera - sono saturanti
0
5
0
10
DC 20
0
0
50
100
150
30
200 104
DC (mM)
Ciò accade per due motivi:
1. Sulla membrana è presente un numero finito di carriers;
2. Ciascun carrier opera ad una velocità finita
Rappresentazione del concetto di
saturazione con un esempio numerico
Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier
Velocità del carrier: 50 p/s
Flusso
1
10
50
50
50
50
Flusso (Particelle/Carrier/s)
N. partic.
1
10
50
100
1000
40
30
20
10
0
0
800
1000
N. particelle
Quesito su cui meditare
Distruggendo la metà dei carriers sulla membrana, Fmax
rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?
Come è stato ottenuto il grafico che illustra come
varia il flusso al variare della concentrazione?
2
Flusso netto [moli/(cm s]
20
C1
15
?
10
5
F1
Cellule in
sospensione
0
0
20
40
60
80
DC (mM)
pendenza
della retta

Si introduce nella provetta substrato S
radioattivo ad una concentrazione C1
2.
A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, …) si
preleva un campione dalla provetta e si
misura la concentrazione di S radioattivo
all’interno delle cellule del campione
3.
Normalizzando la velocità v1 rispetto
all’area della membrana si ottiene il primo
valore del flusso F1 riferito alla
concentrazione C1
100
C1
5
1.
D[ S ]in
 v1
Dt
4
[S]in
3
2
1
0
0
10
20
30
Tempo
40
50
2
Flusso netto [moli/(cm s]
20
F4
F3
15
Successivamente si introduce in ciascuna
provetta substrato S radioattivo alle altre
concentrazioni C2, C3, C4 …. crescenti e si ripete
la stessa procedura descritta precedentemente
F2
10
5
F1
C2
0
0
C2
20 C3
40
60
DC (mM)
80 C4
100
C1
V4F4
40
30
V3F3
[S]in
20
V2F2
10
0
0
10
20
Tempo
30
40
50
C3
C4
I carriers, come gli enzimi, possono
essere soggetti ad inibizione competitiva
2
Flusso netto [moli/(cm s]
Fmax
20
15
+Ic
10
+Ic
5
0
0
50
100
150
200 104
DC (mM)
Quindi, in presenza di inibitore competitivo
il valore di Fmax non cambia.
In presenza di Ic varia ka
Calcolo della costante di affinità ka
F max
20
2
Flusso netto [moli/(cm s]
2
Flusso netto [moli/(cms]
20
15
10
5
0
15
5
0
0
50
100
DC (mM)
150
200
F max
2
10
ka3
0 ka1
ka2
10
DC (mM)
20
30
ka è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è
la metà di quello massimo
ka è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il
substrato
Come funziona un inibitore competitivo?
[S]
[Ic]
Prob
.01
10
.001
.1
10
.010
1
10
.091
10
10
.5
100
10
.909
1000
10
.990
10000
10
.999
solo S
S << Ic
S >> Ic
substrato
Inibitore
comp.
20
Se
15 si vuole costruire un grafico che
rappresenti Sun range di
10
S+Ic
concentrazioni molto ampio (alcuni
5
ordini
di grandezza) conviene usare
una scala logaritmica
0
0
2000
4000
6000
[S]
8000
10000
15
Flusso
Flusso
20
10
5
S
S+Ic
0
0.01
0.1
1
10
[S]
100
1000 10000
Quesito del giorno
Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata
all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come
illustrato in tabella.
1. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana
su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2;
2. Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della
concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni
sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica;
3. Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.
Conc. mM v (mmol/s)
0.1
3.0
1
10.0
5
16.7
10
18.2
20
19.0
30
19.4
50
19.6
100
19.8
200
19.9
Risposta al quesito
600
600
500
500
mmoli/s/cm
mmoli/s/cm
2
700
2
700
400
300
200
100
400
300
200
100
0
0
50
100
Concentr.
150
200
0
0.01
0.1
1
Concentr.
10
100
Esempio di Diffusione facilitata
Il Trasportatore del Glucosio
Glucosio Permeasi
extracell.
intracell.
poro: formato da 5 a-eliche
transmembrana anfipatiche
Diffusione Facilitata
soluto
stato
B
stato
A
esterno
bilayer
lipidico
gradiente di
concentrazione
interno
proteina
carrier
sito di legame
del soluto
es. Trasportatore del glucosio negli epatociti
La driving force per il tranporto in qualsivoglia direzione
è determinata dal gradiente di concentrazione attraverso
la membrana
Attivita' di Ricerca
Responsabili Prof. M. Toselli e Dr. Gerardo Biella
Il LABORATORIO DI FISIOLOGIA E BIOFISICA DEI CANALI IONICI del Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia
Cellulari e Molecolari dell'Universita' di Pavia, diretto dal Prof. Mauro Toselli svolge attivita’ di ricerca sui seguenti
argomenti:
l
Canali ionici voltaggio-dipendenti: proprieta' biofisiche e loro correlazione ad aspetti funzionali dell'eccitabilita'
elettrica nei neuroni durante lo sviluppo.
l
Modulazione dei canali del calcio e Regolazione del traffico intracellulare: meccanismi molecolari e biofisici dei
processi di regolazione dell'attivita' dei canali del calcio voltaggio-dipendenti da parte di protein chinasi e proteine G, e
conseguenze nel controllo della trasmissione, ricezione e immagazinaggio dell'informazione nei neuroni.
l
Neurofisiologia cellulare: Identificazione e caratterizzazione funzionale dei circuiti sinaptici delle cortecce
paraippocampali. In particolare: ruolo che l'attività ritmica sincronizzata dei neuroni del sistema limbico esercita sui
processi di apprendimento e memorizzazione.
l
Cellule staminali neuronali: caratterizzazione elettrofisiologica di cellule staminali neuronali in coltura.
Le tecniche correntemente impiegate comprendono misurazioni elettrofisiologiche di patch-clamp sui seguenti preparati:
a) linee cellulari stabili di origine neuronale, wild-type o opportunamente ingenierizzate per l'espressione di specifiche
proteine ricombinanti normali o mutagenizzate; b) colture primarie di neuroni; c) sezioni sottili di tessuto; d) cellule
staminali in coltura.
Numero di posti disponibili: tre posti disponibili dall’inizio del secondo semestre a dicembre 2005;
Requisiti per l'accettazione: verra’ data la priorita’ agli studenti che abbiano superato gli esami di Fisica e
Chimica Generale.
Alcune considerazioni di
bioenergetica
L’energia è la capacità di compiere un lavoro
Energia del Sistema
Un sistema all’equilibrio non può compiere un
lavoro. Esso è al minimo della collina energetica
Equilibrio
La parte di Energia che il sistema può utilizzare per
compiere un lavoro è definita energia libera del sistema
Le reazioni non all’equilibrio
spontaneamente procederanno nella
direzione che porta all’equilibrio
Tali reazioni sono dette esoergoniche
Una reazione può essere forzata a procedere in senso non spontaneo.
In questo caso la reazione assorbe energia: cioè occorre compiere un
lavoro sul sistema
Una reazione di questo tipo è detta endoergonica
Le reazioni chimiche accoppiate
Un processo endoergonico può avvenire se esso viene
opportunamente accoppiato ad un processo esoergonico
Consideriamo la seguente reazione endoergonica:
A + B  A-B
DG>0
Affinchè essa possa avvenire deve attingere energia da una reazione
esoergonica:
X-P  X + P + Energia
DG<0
La sequenza di reazioni accoppiate sarà la seguente:
A + X-P  A-P + X

A-P + B  A-B + P
I contenitori di energia nelle cellule
Legami ad alta energia: ATP
GTP
Gradienti transmembranari:
Gradienti ionici a cavallo del plasmalemma
Contenitori intracellulari di Ca2+
Trasporti passivi e attivi a confronto
molecola trasportata
proteina
carrier
gradiente di
concentraz.
bilayer
lipidico
diffusione
semplice
mediata
da canale
mediata da
carrier
trasporto
passivo
trasporto
attivo
Trasporti passivi e attivi a confronto
• Il gradiente di concentrazione attraverso la membrana
determina la direzione e la velocità della diffusione
passiva.
• Nella diffusione passiva le molecole si muovono dalla
zona ad alta concentrazione a quella a bassa
concentrazione (trasporto “in discesa”)
• Diffusione semplice: le molecole diffondono attraverso
il bilayer lipidico
• Diffusione facilitata: diffusione attraverso la
membrana mediata da proteine di trasporto (non è
richiesta energia)
• Muovere un soluto “in salita” (contro il gradiente di
concentrazione) richiede un ingresso di energia Trasporto Attivo
Trasporti Attivi
Il trasporto di un soluto contro un gradiente elettrochimico
richiede l’utilizzo di energia
Due strategie sono adottate dalle cellule animali:
Pompe ATP-dipendenti
Trasporti accoppiati
Gradiente
elettrochimico
Trasporto in salita
accoppiato direttamente
all’idrolisi dell’ATP
Trasporto in salita di una
molecola
accoppiato
al trasporto in discesa di
un’altra
Na+/K+ ATPasi
Na+/K+ ATPasi
sito di legame
per K+ e ouabaina
gradiente
di K+
gradiente
di Na+
cytosol
sito di legame
del Na+
Na+/K+ ATPasi
• La pompa idrolizza l’ATP ad ADP per trasportare
simultaneamente 3 Na+ dalla cellula e 2 K+ dentro la cellula
ad ogni ciclo della pompa
• La Na+-K+ ATPasi è responsabile di >30% del consumo
totale di ATP
• Mantiene un gradiente del Na+ (ext>int) e del K+ (int>ext)
• Contribuisce a creare un potenziale di membrana negativo
all’interno
• È bloccata dalla ouabaina
Ione
Intracellulare
Na+
K+
5-15 mM
140 mM
Extracellulare
145 mM
5 mM
Ciclo della pompa Na+/K+ ATPasi
la proteina subisce un
cambiamento
conformazionale, il Na è
rilasciato all’esterno
fosforilazione
ATP-dipendente
ext
int
il Na si lega
al sito
citosolico
il K si lega
al sito
extracellulare
la proteina ritorna alla
conformazione originale,
il K è rilasciato all’interno
defosforilazione
1 ciclo  10 millisecondi
Alcune importanti caratteristiche della pompa
Velocità di attività dipendente dalla concentrazione intracellulare di Na+
Bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e bassa [ATP]i
Stechiometria - 3 Na+ fuori, 2 K+ dentro, 1 ATP usato
Elettrogenica, può generare direttamente da -2 a -20 mV
Tiene la pressione osmotica sotto controllo, prevenendo il rigonfiamento
cellulare
Gradiente elettrochimico
• A cavallo della membrana della maggior parte delle cellule
c’è una differenza di potenziale elettrico – il potenziale di
membrana
• Il potenziale di membrana influenza il movimento
transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni)
• Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica di solito ha
un potenziale più negativo rispetto all’esterno
• La forza elettrostatica spinge i cationi nella cellula e guida
gli anioni fuori
• Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva di soluti
carichi attraverso una membrana, due forze devono essere
considerate:
• (a) il gradiente di concentrazione transmembrana
• (b) la differenza di potenziale transmembrana
• La driving force netta = Gradiente Elettrochimico
Gradiente Elettrochimico
fuori
dentro
potenziale di
membrana=0
potenziale di membrana
negativo dentro
 trasporto dei cationi
aumentato
potenziale di membrana
positivo dentro
 trasporto dei cationi
ridotto
Quesito del giorno
In base a quanto detto a lezione, stabilire se la pompa Na+/K+,
che è elettrogenica dal momento che trasporta un numero
netto di cariche elettriche, aumenterà o diminuirà la sua
velocità d’azione qualora la membrana venga depolarizzata.
Ricordarsi che una depolarizzazione comporta un aumento
delle cariche positive all’interno della cellula rispetto alla
situazione di riposo (potenziale di riposo).
Alcune definizioni
molecola trasportata
ione co-transportato
ione controtransportato
Uniporto
Simporto
Antiporto
Trasporti accoppiati
Altri esempi di trasporti attivi primari
Trasporti accoppiati
Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na+) viene
usato per guidare in salita il trasporto di una seconda
molecola - trasporto attivo secondario
Gradiente
elettrochimico
Trasporto in salita di una
molecola
accoppiato
al trasporto in discesa di
un’altra
Trasporti accoppiati al gradiente di Na
Nelle cellule animali molti processi di trasporto di
membrana sono accoppiati al gradiente del Na.
Es. Trasporto del glucosio in cellule dell’epitelio intestinale
Na+
gradiente
di Na
carrier
stato stato
A
B
glucosio
ext
gradiente
di glucosio
int
Stechiometria: 2 Na+  1 Glc
Bloccante: florizina
Altri esempi di trasporti attivi secondari
Trasporto del glucosio dal lume intestinale al sangue
Sangue
GLU
permeasi
Glucosio
nel sangue
Canale del K+
Cellule
dell’epitelio
intestinale
Glucosio
assunto
Co-trasportatore
Na/GLU
Lume intest.
Quesito del giorno
Una cellula si trova immersa in una soluzione
extracellulare contenente glucosio 10 mM. Trascorso un
certo tempo la concentrazione di glucosio nel citoplasma
sale a 50 mM.
Secondo voi, perche’ cio’ prova che la membrana
plasmatica di quella cellula dispone di un trasportatore
attivo del glucosio?
Come fareste a dimostrare sperimentalmente che tale
trasportatore e’ Na+-dipendente (trasporto attivo
secondario)?
Mantenimento dei livelli di Ca2+ intracellulare
• Il Ca2+ è coinvolto in molti processi cellulari
• Il mantenimento di bassi livelli di Ca2+ intracellulare è critico
for il normale funczionamento cellulare
•
La [Ca2+] extracellulare >>>> della [Ca2+] intracellulare
• Le pompe del Ca2+ ATP-dipendenti della membrana
plasmatica
e
del
reticolo
endoplasmatico
pompano
attivamente Ca2+ fuori dal citoplasma
• Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che pompa
attivamente Ca2+ fuori dalla cellula
Quali meccanismi mantengono l’ampio
gradiente di calcio?
3Na
+
ESTERNO
INTERNO
ATP
Ca++
ADP
Pompa del Calcio
Ca++
Scambiatore Sodio:Calcio
I gradienti di calcio esistono sia all’interno della cellula
che a cavallo della membrana plasmatica
Contrazione
Ca2+
Secrezione
Ca2+
+
Esocitosi
Ca2+
Ca2+
Espressione
di geni
Secondo
messaggero
Ca2+
Ca2+
Na+
Concentrazioni ioniche intracellulari ed extracellulari
Ione
Intracellulare
Extracellulare
Na+
K+
Mg2+
Ca2+
H+
5-15 mM
140 mM
0.5 mM
10-7 mM
10-7.2 M (pH 7.2)
145 mM
5 mM
1-2 mM
1-2 mM
10-7.4 M (pH 7.4)
ClAnioni fissi
5-15 mM
high
110 mM
0 mM
La [intracellulare] è molto diversa dalla [extracellulare]
I cationi sono bilanciati dagli anioni
C:\Documents and
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Columbia Biology 350
Bioenergetics.doc