UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO
Facoltà di Scienze MM. FF. NN.
Corso di Laurea in Scienze Biologiche
anno accademico 2008-2009
Laboratorio Multidisciplinare
Modulo di Microbiologia
C.M. Maida
Dip. Scienze per la Promozione della Salute
Facoltà di Medicina e Chirurgia
I batteri differiscono per morfologia (dimensione, forma e
caratteristiche di colorazione), caratteristiche metaboliche,
antigeniche e genetiche. Benchè sia difficile differenziare i
batteri in base alle dimensioni, è facile distinguerli in base
alla forma.
microscopia ottica
microscopia elettronica
Una cellula batterica risulta formata da diverse componenti
citoplasmatiche ed esterne.
• GENOMA
• CITOPLASMA
• MEMBRANA CITOPLASMATICA
• PARETE BATTERICA
• FLAGELLI
• CAPSULA
• PILI
• SPORE
PARETE CELLULARE
Una caratteristica della cellula batterica è quella di essere
racchiusa in un contenitore rigido che ne condiziona la forma
e ne conferisce rigidità strutturale.
In base alle caratteristiche morfologiche e strutturali della
parete cellulare i batteri vengono distinti in Gram positivi e
Gram negativi.
Solamente i micobatteri non possono essere colorati con il
metodo di Gram perché possiedono una parete differente.
Il componente fondamentale della parete è un enorme
polimero chiamato PEPTIDOGLICANO, formato dalla
ripetizione di un’unità strutturale assolutamente peculiare
della cellula procariota.
Mycobacterium cell wall
GRAM POSITIVI
Un batterio Gram positivo ha una
parete spessa e multistratificata
formata principalmente da
peptidoglicano che circonda la
membrana citoplasmatica.
La parete dei Gram + può
includere anche altri componenti
come acidi teicoici (legati
covalentemente al
peptidoglicano), lipoteicoici
(legati alla membrana
citoplasmatica) e polisaccaridi
complessi.
Gli acidi teicoici sono fattori di
virulenza.
GRAM NEGATIVI
Strutturalmente presentano:
- un sottile strato di peptidoglicano
- una membrana esterna chiamata
LPS (endotossina)
Non sono presenti acidi teicoici ne
lipoteicoici.
Tra i due rivestimenti è presente
uno spazio chiamato
PERISPLASMATICO.
L’endotossina (Lipide A)
svolge la sua azione
patogena attraverso i
seguenti meccanismi:
 Attivazione del complemento
 Attivazione dei macrofagi
 Induzione di interferone
 Induzione di interleuchine
 Attivazione dei granulociti
 Pirogenicità
Gram +
Gram -
Gram -
Gram +
COLORAZIONE DI GRAM
I batteri reagiscono in maniera differente alla colorazione di
Gram, in base alla diversa permeabilità degli involucri cellulari
(a causa di una differente morfologia e composizione) che è
maggiore nei Gram – e minore nei Gram +.
I batteri Gram + non rilasciano il colorante primario se trattati
con alcool, mentre i batteri Gram – si decolorano facilmente.
Si fonda sulla proprietà che ha il cristalvioletto di combinarsi
con lo iodio dando composti non dissociabili con l’alcool.
modalità di esecuzione:
distensione della sospensione
fissazione al calore su un vetrino
colorazione con cristal-violetto
precipitazione con iodio-ioduro
di potassio
decolorazione con alcool
colorazione con safranina
I batteri Gram + conservano la
colorazione blu del cristalvioletto; i batteri
Gram - vengono prima decolorati con
l’alcool e poi ricolorati con la safranina.
Gram +
Gram -
Gram -
Gram +
Gram -
Coltura mista
Coltura mista
Gram +
ESAME COLTURALE
Lo sviluppo della batteriologia ebbe inizio solo quando fu
trovata la possibilità di coltivare i batteri nei terreni di
coltura.
TERRENO DI COLTURA: substrato artificiale costituito da
sostanze più o meno complesse capace di mantenere la
vitalità e di permettere la riproduzione dei batteri fuori dal
loro “habitat” naturale.
La crescita batterica si verifica nei terreni di coltura dopo un certo
periodo di tempo, detto “periodo d’incubazione” (24-48 ore);
durante questo periodo è necessario che le colture siano tenute a
temperatura ottimale.
CASSIFICAZIONE DEI TERRENI
1. In base allo stato:
 LIQUIDI
 SEMISOLIDI
 SOLIDI
2. In base alla complessità
 SEMPLICI A COMPOSIZIONE DEFINITA
 COMPLESSI
3. In base alle proprietà selettive o differenziali
 NON SELETTIVI
 SELETTIVI
 DIFFERENZIALI
In base allo stato – I TERRENI LIQUIDI
Furono i primi terreni di coltura usati in batteriologia.
Vengono utilizzati per la coltivazione dei batteri.
I terreni liquidi di uso comune
sono:
 brodo nutritivo –
si ottiene dalla
infusione a temperatura ambiente
della carne di bue privato del grasso,
delle aponevrosi, dei tendini;
 acqua peptonata – si ottiene dallo
scioglimento di peptone 1% e di
cloruro di sodio 0,5% in acqua
distillata.
In base allo stato – I TERRENI SEMISOLIDI
In base allo stato – I TERRENI SOLIDI
Agar triptosio
Baird parker
Agar sangue
Mac Conkey
Agar cioccolato
Mac Conkey
FONDAMENTI DELLA CONTA MICROBICA
I batteri, seminati in une terreni solido agarizzato ed
incubati in termostato, si riproducono formando ammassi
rotondeggianti, eventualmente pigmentati, dette colonia.
Ogni colonia origina da una singola cellula batterica (in
genere diventano visibili dopo almeno 18 ore di incubazione,
quando si raggiunge una carica di almeno 1.000.000 cellule)
• Ogni batterio, crescendo, si divide e produce una singola colonia;
• L’inoculo originale è omogeneo;
•Non sono seminati aggregati cellulari
1 / fattore di diluizione
1590 (CFU / ml) x 103 = 1,59 x 106 CFU/ml
0,1 ml
159 (CFU) : 0,1 (ml) = 1590 (CFU / ml)
1 / fattore di diluizione
2,03 x 103 (CFU / ml) x 104 = 2,03 x 107
CFU / ml
0,1 ml
203
203 (CFU) : 0,1 (ml) = 2030 (CFU / ml) = 2,03 x 103 (CFU / ml)
1 / fattore di diluizione
1,4 x 102 (CFU / ml) x 104 = 1,4 x 106
CFU / ml
0,5 ml
70
70 (CFU) : 0,5 (ml) = 140 (CFU / ml) = 1,4 x102 (CFU / ml)
1,5 x 105 CFU / ml
1,5 x 104 1,5 x 103
CFU / ml CFU / ml
1,5 x 102
CFU / ml
1,5 x 101
CFU / ml
1 ml
15
1,5
1,5 x 10-1
CFU / ml CFU / ml
1,5 x 105 CFU / ml
1,5 x 105 CFU
1,5 x 104
CFU / ml
1,5 x 103
CFU / ml
1,5 x 102
CFU / ml
/ ml
1,5 x 101
1,5
1,5 x 10-1
CFU / ml CFU / ml CFU / ml
1 ml
1o2
colonie
Inoculazione
Interpretazione
20 mm