ALLA SCOPERTA
DEL DNA
STORIA
Miescher
 1869: il biochimico svizzero Friedrich Miescher individua
una sostanza microscopica contenuta nel pus di bende chirurgiche
utilizzate. Dal momento che tale molecola aveva la sua
localizzazione nel nucleo, egli la chiamò nucleina.
 1919:Phoebus Levene individuò la struttura del nucleotide,
composta da base azotata, zucchero e fosfato. suggerì che il DNA
consistesse in un filamento di nucleotidi legati tra loro attraverso i
fosfati.
Griffith
 1928:Frederick Griffith scoprì, che i caratteri della forma
Levene
smooth, (liscia) di Pneumococcus potevano essere trasferiti alla
forma rough (rugosa) miscelando i resti di batteri smooth morti con
batteri rough vivi. Questo sistema, pur non fornendo nessuna
evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il
cambiamento, mostrava comunque che qualcosa potesse
trasportare l'informazione genetica dai resti dei batteri morti a
quelli vivi. Si parlò quindi di un principio trasformante in grado di
modificare i batteri vivi
Hershey
e chase
 1937 :William Astbury presentò i primi risultati di alcuni
studi di diffrazione a raggi X, che dimostrarono che il DNA ha
una struttura estremamente regolare.
Avery
 1943 :Oswald Theodore Avery dimostrò in un celebre
esperimento insieme a Colin MacLeod e Maclyn McCarty, che
il DNA è il principio trasformante alla base di questo fenomeno.
 1953:Alfred Hershey e Martha Chase dimostrarono
attraverso un altro classico esperimento, che il materiale
genetico del fago T2 è effettivamente il DNA.

Astbury
Nello stesso anno,attraverso ulteriori immagini da diffrazione
a raggi X realizzate da Rosalind Franklin, chimica-fisica
inglese, James Watson e Francis Crick presentarono sulla
rivista Nature quello che è oggi accertato come il primo
modello accurato della struttura del DNA,quello della doppia
elica. A disegnarne il bozzetto fu Odile Speed, pittrice e moglie
di Crick.
Holley,Khorana e Nirenberg
Watson e Crick
 1957:In una importante presentazione Crick propose il
dogma centrale della biologia molecolare, che fissa le
relazioni tra DNA, RNA e proteine.
 1958: La conferma finale del meccanismo di
replicazione basato sulla struttura a doppia elica fu fornita
dall'esperimento di Meselson-Stahl. Un successivo lavoro
di Crick dimostrò come il codice genetico fosse basato su
triplette di basi non sovrapposte, permettendo ad Har
Gobind Khorana, Robert Holley e Marshall Warren
Nirenberg di decifrarlo.Queste scoperte sono alla base
della moderna biologia molecolare.
Franklin
1962:dopo la morte di Rosalind Franklin (a causa di
un tumore provocato, probabilmente, dalle alte dosi di
raggi X a cui si era esposta nel corso dei suoi esperimenti),
Watson, Crick e Wilkins ricevettero congiuntamente il
Premio Nobel per la medicina
COMPOSIZIONE

Il DNA è un lungo polimero costituito da unità ripetute di
nucleotidi. La catena del DNA è larga tra i 22 ed i 26 Ångström
(da 2,2 a 2,6 nanometri) ed ogni unità nucleotidica è lunga
3,3 Ångstrom (0,33 nanometri).Sebbene ogni unità occupi uno
spazio decisamente ridotto, la lunghezza dei polimeri di DNA
può essere sorprendentemente elevata, dal momento che
ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad
esempio, il più grande cromosoma umano (il cromosoma 1)
contiene quasi 250 milioni di paia di basi.

Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto
forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti
saldamente associati tra loro.Essi si intrecciano tra loro a
formare una struttura definita doppia elica. Ogni nucleotide è
costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame
covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata,
che instaura legami idrogeno con la corrispondente base
azotata presente sul filamento opposto. Il composto formato
da una base azotata legata allo zucchero è definito
nucleoside; un nucleotide è invece un nucleoside a cui sono
legati uno o più gruppi fosfato.
 La struttura laterale del DNA è composta da
unità ripetute ed alternate di gruppi fosfato e
di 2-deossiribosio,uno zucchero pentoso (a
cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati
adiacenti attraverso legami fosfodiesterici
presso il terzo ed il quinto carbonio;
Conseguenza di questi legami asimmetrici è
che ogni filamento di DNA ha un senso,
determinato dalla direzione dei legami
fosfodiesterici. In una doppia elica, il senso di
un filamento è opposto a quello del filamento
complementare. Per tale motivo, i due
filamenti che costituiscono una doppia elica
sono detti antiparalleli. La principale
differenza tra il DNA e l'RNA è lo zucchero
pentoso utilizzato: l'RNA utilizza, infatti, il
ribosio.
 La doppia elica del DNA è stabilizzata dai
legami idrogeno che si instaurano tra le basi
azotate presenti sui due filamenti. Le quattro
basi che sono state individuate nel DNA sono
l'adenina (abbreviata con la lettera A), la
citosina (C), la guanina (G) e la timina (T).
Adenina e guanina sono composti eterociclici
chiamati purine, mentre citosina e timina sono
anelli pirimidinici. Esiste una quinta base, di
tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa
non è di norma presente nelle catene di DNA.
L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA
al posto della timina, da cui si differenzia per la
mancanza di un gruppo metile.
 La doppia elica è una spirale destrorsa. Con
l'avvitarsi su sé stessi dei due filamenti,
restano esposti dei solchi tra i diversi gruppi
fosfato.
APPAIAMENTO DELLE BASI


Ogni tipo di base presente su un filamento forma un legame
con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto
come appaiamento complementare. Le basi puriniche formano
legami idrogeno con le basi pirimidiniche: A può legare solo T
e G può legare solo C. L'associazione di due basi viene
comunemente chiamata paio di basi ed è l'unità di misura
maggiormente utilizzata per definire la lunghezza di una
molecola di DNA. Dal momento che i legami idrogeno non
sono covalenti, essi possono esser rotti e riuniti in modo
relativamente semplice. Conseguenza di questa
complementarità è che tutte le informazioni contenute nella
doppia elica possono essere duplicate a partire da entrambi i
filamenti.
I due tipi di paia di basi formano un numero differente di
legami idrogeno: A e T ne formano due, G e C tre. Per tale
motivo, la stabilità del legame GC è decisamente maggiore di
quello AT. Di conseguenza, la stabilità complessiva di una
molecola di DNA è direttamente correlata alla frequenza di GC
presenti nella molecola stessa, nonché alla lunghezza
dell'elica: una molecola di DNA è dunque tanto più stabile
quanto più contiene GC ed è lunga.
SENSO E ANTISENSO
 Una sequenza di DNA è definita senso se
la sua sequenza è la stessa del relativo
mRNA. La sequenza posta sul filamento
opposto è invece detta antisenso. Dal
momento che le RNA polimerasi lavorano
producendo una copia complementare, il
filamento necessario per la trascrizione è
l'antisenso. Sia nei procarioti che negli
eucarioti vengono prodotte numerose
molecole di RNA antisenso a partire dalle
sequenze senso. La funzione di questi RNA
non codificanti non è stata ancora
completamente chiarita. Si ritiene che gli
RNA antisenso possano giocare un ruolo
nella regolazione dell'espressione genica.
DANNI AL DNA

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Il DNA può essere alterato dall'azione di numerosi agenti,
genericamente definiti mutageni. Tra di essi figurano ad
esempio agenti ossidanti, agenti alchilani ed anche radiazioni
ad alta energia.Il tipo di danno causato al DNA dipende dal
tipo di agente: gli UV, ad esempio, danneggiano il DNA
generando la formazione di dimeri di timina, costituiti da
ponti aberranti che si instaurano tra basi pirimidiniche
adiacenti. Agenti ossidanti come i radicali liberi o il perossido
di idrogeno, invece, producono danni di tipo più eterogeneo,
come modificazioni di basi (in particolare di guanine) o rotture
del DNA a doppio filamento
Molti agenti devono il loro potere mutageno alla capacità di
intercalarsi tra due basi azotate consecutive. Gli intercalanti
sono tipicamente molecole planari e aromatiche, come
l'etidio.Perché un intercalante possa trovare posto tra le due
basi, occorre che la doppia elica si apra e perda la sua
conformazione standard. Tali modifiche strutturali inibiscono
sia la trascrizione che la replicazione del DNA ed aumentano
la possibilità di insorgenza di mutazioni. Per tale motivo, gli
intercalanti sono considerati molecole cancerogene. In ogni
caso, proprio grazie alla loro capacità di inibire trascrizione e
replicazione, tali molecole sono anche utilizzate in
chemioterapia per inibire le cellule neoplastiche a rapida
crescita.
DISPOSIZIONE DEL DNA
L'avvolgimento del DNA
(in rosa) attorno agli
istoni (in blu)
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Negli eucarioti, il DNA è solitamente presente all'interno di
cromosomi lineari (circolari nei procarioti). La somma di tutti i
cromosomi di una cellula ne costituisce il genoma; il genoma
umano conta circa 3 miliardi di paia di basi contenute in 46
cromosomi.
La disposizione finale a cromosomi segue precise regole
gerarchiche di impacchettamento. Nelle cellule, infatti, il
doppio filamento di DNA non può essere disposto a casaccio,
ma deve seguire precise regole di ordinamento. Tali
accorgimenti si rivelano necessari perché la lunghezza dei
filamenti di DNA è solitamente molto elevata e creerebbe seri
problemi alla cellula ospite. Ad esempio, il cromosoma di
Escherichia coli, il procariote più studiato nella storia della
biomedicina, misura circa 1 mm. In una cellula lunga solo 2
μm, come quella di E.coli, la disposizione casuale di un
cromosoma del genere potrebbe generare problemi. Se una
molecola di questa lunghezza si disponesse casualmente,
infatti, ci sarebbe bisogno di una cellula grande almeno 1000
volte tanto. Le modalità di impacchettamento sono differenti
tra gli organismi procarioti e quelli eucarioti.
STRUTTURA DEL GENOMA
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Nel genoma, l'informazione è conservata in sequenze di DNA
chiamate geni.
Negli organismi eucarioti, il DNA genomico è localizzato
all'interno del nucleo cellulare, nonché in piccole quantità
all'interno di mitocondri e cloroplasti.
Nei procarioti, il DNA è invece racchiuso in un organello
irregolare, privo di membrana, contenuto nel citoplasma,
chiamato nucleoide.
In molte specie, solo una piccola frazione della sequenza
totale di un genoma può essere trascritta e tradotta.
Alcune sequenze non codificanti ricoprono un ruolo strutturale
per i cromosomi. Le regioni telomeriche e centromeriche
contengono solitamente pochissimi geni, ma sono necessarie
per la funzione e la stabilità dei cromosomi. Nell'uomo, grandi
quantità di DNA non codificante si ritrovano negli pseudogeni,
copie di geni rese inattive dalla presenza di una mutazione.
Queste sequenze sono considerate come fossili molecolari,
anche se esistono evidenze secondo le quali si può ipotizzare
che siano una sorta di materiale grezzo necessario per la
creazione di nuovi geni attraverso i processi di duplicazione
genica e di evoluzione divergente.
TRASCRIZIONE E TRADUZIONE
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Un gene è una sequenza di DNA che contiene le
informazioni in grado di influire sulle caratteristiche
del fenotipo dell'organismo. All'interno di un gene,
la sequenza di basi di DNA è utilizzata come stampo
per la sintesi di una molecola di RNA che, nella
maggior parte dei casi, è tradotta in una molecola
peptidica.
Il meccanismo attraverso il quale la sequenza
nucleotidica di un gene è copiata in un filamento di
RNA è detto trascrizione ed avviene per mezzo
dell'enzima RNA polimerasi.
Il processo di traduzione avviene nel citoplasma,
dove gli mRNA si associano ai ribosomi, ed è
mediato dal codice genetico. Il ribosoma permette
la lettura sequenziale dei codoni del mRNA,
favorendone il riconoscimento e l'interazione con
specifici tRNA, molecole che trasportano gli
amminoacidi corrispondenti ad ogni singolo
codone.
CODICE GENETICO
 Il codice genetico consiste in parole di tre
lettere chiamate codoni, costituite dalla
sequenza di tre nucleotidi (ad esempio
ACT, CAG, TTT), ognuna delle quali è
associata ad un particolare amminoacido.
Ad esempio la timina ripetuta in una serie
di tre (TTT) codifica per la fenilalanina.
Utilizzando gruppi di tre lettere si possono
avere fino a 64 combinazioni diverse (43),
in grado di codificare per i venti diversi
amminoacidi esistenti. Poiché esistono 64
triplette possibili e solo 20 amminoacidi, il
codice genetico è detto ridondante (o
degenere).
REPLICAZIONE

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La divisione cellulare, necessaria ad un organismo per
crescere, richiede una duplicazione del DNA cellulare, in modo
che le cellule figlie possano avere la stessa informazione
genetica della cellula madre. La struttura a doppia elica del
DNA permette un meccanismo estremamente semplice per la
replicazione del DNA. I due filamenti, infatti, sono separati e
da ognuno viene creato un filamento complementare, ad
opera di un enzima chiamato DNA polimerasi.
Per iniziare la replicazione, occorre anzitutto l'apertura della
forca replicativa, attraverso la parziale denaturazione del DNA
a doppia elica, portata a termine dalle elicasi:sono enzimi che
separano attivamente i due filamenti usando l'energia
dell'ATP; Nelle molecole di DNA circolari dei procarioti si ha
una sola regione di origine della replicazione dalla quale
partono due forche replicative (la struttura prende il nome di
bolla di replicazione). Quando le due forche si incontrano dal
lato opposto la replicazione è completata. Negli eucarioti la
replicazione di ogni cromosoma inizia invece in più punti.


Le DNA polimerasi, enzimi capaci di costruire una
nuova catena solo in direzione 5'-3', sono stati
individuati per la prima volta da Arthur Kornberg.
Dal momento che le DNA polimerasi sono in grado
di svolgere la loro attività solo in direzione 5'-3', esse
hanno messo a punto diversi meccanismi per
copiare i due filamenti della doppia elica. Un
filamento (chiamato filamento veloce) può essere
replicato in modo quasi continuo, man mano che
viene esposto, l'altro (filamento lento) risulta invece
disseminato da brevi filamenti di DNA di nuova
sintesi (i frammenti di Okazaki), ognuno dei quali
presenta un innesco iniziale di RNA. I nuovi
filamenti devono essere quindi completati
mediante la rimozione degli inneschi da parte di
endonucleasi e il riempimento degli spazi rimasti ad
opera di polimerasi di riparazione. Successivamente
tutti questi frammenti di DNA di nuova sintesi del
filamento lento vengono legati dalle DNA ligasi.
PROTEINE CHE LEGANO IL DNA
 Le proteine strutturali che legano il DNA
sono esempi delle interazioni aspecifiche
tra DNA e proteine. All'interno dei
cromosomi, il DNA è associato a
complessi di natura proteica, che si
organizzano tra loro a formare una
struttura compatta chiamata cromatina.
Negli eucarioti, questa struttura
presuppone il legame del DNA a piccoli
complessi proteici basici chiamati istoni.
 Nei procarioti, invece, sono coinvolti
diversI tipi di differenti proteine. Gli istoni
formano un complesso a forma di disco
chiamato nucleosoma.
ENZIMI CHE MODIFICANO IL DNA
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Nucleasi e ligasi
Le nucleasi sono enzimi in grado di tagliare filamenti di DNA, dal
momento che catalizzano l'idrolisi del legame fosfodiesterico.
Le DNA ligasi sono enzimi in grado di riunire filamenti di DNA
precedentemente tagliati o spezzati, utilizzando energia chimica
proveniente da ATP o da NAD.
Topoisomerasi ed elicasi
Le topoisomerasi sono enzimi che presentano sia un'attività
nucleasica che una ligasica. Queste proteine sono in grado di
modificare le proprietà topologiche del DNA.
Le elicasi sono proteine in grado di utilizzare l'energia chimica
presente nei nucleosidi trifosfato, soprattutto ATP, per rompere i
legami idrogeno che si instaurano tra le basi azotate, permettendo
l'apertura della doppia elica di DNA in singoli filamenti
Polimerasi
Le polimerasi sono enzimi che sintetizzano catene
polinucleotidiche a partire dal nucleosidi trifosfato.Nel sito attivo
di questi enzimi, il nucleoside trifosfato si appaia ad un nucleotide
presente su un filamento usato come stampo: ciò permette alle
polimerasi di sintetizzare in modo accurato filamenti fedelmente
complementari agli stampi. Le polimerasi sono classificate sulla
base del tipo di stampo che utilizzano.