Esempi di
modelli cinetici
1 Gating dei canali: modello a due stati
ko
C
kc
O
d[C ]
 k o  [ C ]  k c  [ O ]
dt
d[O]
 ko  [ C ]  kc  [ O ]
dt
Mean open time (MOT) = 1/kc
Mean closed time (MCT) = 1/ko
Inoltre, allo stato stazionario:
dPO/dt = ko - (ko + kc)Po = 0

Po = ko/(ko + kc)
Gating dei canali:
Simulazioni di 2 Stati
Cinetica lenta: ko=0.5/ms kc=0.5/ms
0
1
2
Tempo (ms)
Significato di ko:
Significato di kc:
Per ogni ms che il canale è
nello stato aperto, esso in
media si chiuderà 0.5 volte.
4
0
1
2
Tempo (ms)
3
4
Significato di ko:
1.0
Open Prob
Per ogni ms che il canale è
nello stato chiuso, esso in
media si aprirà 0.5 volte.
3
Cinetica rapida: ko=5/ms kc=5/ms
Po=0.5
0.8
0.6
0.4
0.2
Per ogni ms che il canale è
nello stato chiuso, esso in
media si aprirà 5 volte
Significato di kc:
Po=0.5
0.0
0
1
2
Tempo (ms)
3
4
Per ogni ms che il canale è
nello stato aperto, esso in
media si chiuderà 5 volte.
Gating dei canali:
Altre simulazioni a due stati
Alta Po: ko=5/ms kc=0.5/ms
1
2
Tempo (ms)
3
4
0
1
2
Tempo (ms)
1.0
Open Prob
0
Bassa Po: ko=0.5/ms kc=5/ms
Po=0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
Po=0.1
0.0
0
1
2
Tempo (ms)
3
4
3
4
Canale K+
Depolarizz.
Livelli energetici
O
O
C
Costanti di velocità
C
100
1
C
O
100
C
O
1
+50 mV
Voltaggio
-100 mV
Corrente attraverso
singoli canali
Corrente attraverso
molti canali
10 ms
2
Gating dei canali: Modello a 3 Stati
con inattivazione
C
ko
kc
O
k+i
k-i
I
Si applica a canali V-dipendenti inattivanti
d[C ]
 k o  [ C ]  k c  [ O ]
dt
d[O]
 k o  [ C ]  k  i  [ O ]  k c  [ O ]  k i [ I ]
dt
d[I ]
 k  i  [ O ]  k i  [ I ]
dt
Gating dei Canali:
correnti medie con 3 Stati e inattivazione
C
ko
O
kc
k+i
I
k-i
1.0
Popen
Open Prob
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
10
20
30
tempo (ms)
ko = 0.5/ms kc =0.005/ms
k+i = 0.25/ms k-i = 0.025/ms
k+i = 0/ms
k-i = 0/ms
40
50
Relazioni tra costanti di velocità e costanti di tempo
in un modello a tre stati con inattivazione
ko
C
kc
O
k+i
k-i
I
MOT = 1/(kc+k+i)
MCT = 1/ ko
MIT =1/k-i (tempo medio dello stato inattivato)
MOB*=(kC/ k+i)+1 (numero medio di aperture/burst)
Regola generale: il tempo medio che il canale trascorre in uno stato è
uguale all’inverso della somma delle costanti di velocità che si
allontanano da quello stato
* Qualora il flikering sia tra C e O; altrimenti, se fosse tra O e I allora sarebbe: MOB=(k +i/ kC)+1
Diversi gradi di inattivazione
C
ko
kc
ko = 0.5/ms
k+i = 0.25/ms
kc =0.005/ms
k -i = 0.025/ms
O
k+i
k-i
ko = 0.5/ms
kc =0.005/ms
K +i = 0.25/ms k-i = 0.1/ms
I
ko = 0.5/ms
kc =0.005/ms
K +i = 0.25/ms k -i = 0.25/ms
All’aumentare di k-i diminuisce il grado di inattivazione
Canale del Na+
Depolarizz.
C
Livelli energetici
O
O
I
C
Costanti di velocità
1000
2
C
2000
I
O
20000
Voltaggio
I
10
C
1000
I
O
20
10
+10 mV
-100 mV
Corrente attraverso
singoli canali
Corrente attraverso
molti canali
1 ms
Che informazioni possono darci
registrazioni di singolo canale circa il
gating che già non abbiamo appreso dallo
studio delle correnti macroscopiche?
Seguirà una reinterpretazione del gating del canale del
Na+ VD basata su registrazioni di singolo canale.
Aldrich, Corey, Stevens Nature (1983)
Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni
“A reinterpretation of mammalian sodium channel gating based on single channel recording”
Aldrich, Corey & Stevens – NATURE (1983)
Modello di H. & H.
Modello alternativo
Attivazione rapida
Inattivazione lenta (e volt.dip.)
Attivazione lenta
Inattivazione rapida (e volt.indip.)
+10
+10
-100
-100
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni
Modello di H. & H.
Modello alternativo
Attivazione lenta
Inattivazione rapida (e volt.indip.)
Attivazione rapida
Inattivazione lenta (e volt.dip.)
+10
+10
-100
-100
L’analisi della latenza permette di discriminare tra i due modelli
45
100
40
35
N. degli Eventi
N. degli Eventi
80
l=2 ms
60
40
30
l=10 ms
25
20
15
10
20
5
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
10
Latenza (ms)
C
400
20
O
100
20
30
40
50
Latenza (ms)
I
C
100
20
O
800
I
3
Gating dei canali: Modello a 3 Stati
Un semplice schema di blocco
Si applica a bloccanti del canale aperto
canale non bloccato
canale bloccato
C
O
+B
a
C
b
O
k+B·[B]
k-B
burst
burst
B
Ricordarsi che la transizione O → B è data da k+B · [B], dove [B] è la
concentrazione del bloccante.
u.d.m.: k+B · [B] (s-1), [B] (M)  k+B (M-1·s-1)
Mean open time (MOT) = 1/(b  k+B · [B])
Mean closed time tra i bursts (MCT) = 1/a
Mean closed time all’interno dei bursts (MBT) = 1/k-B
Mean opening per burst (MOB)=(k+B· [B]/b)+1
Effetto della concentrazione del bloccante
a
C
k+B·[B]
O
b
k-B
Ricavabile dall’analisi dei
tempi medi di apertura
B
a
b
k-B
k+B·[B]
[B]
to
1/to=b+k+B·[B]
k+B=(1/to-b)/[B]
s-1
s-1
s-1
s-1
mM
ms
ms-1
M-1·s-1
500
1000
100
500
50
0.67
1.49
9.9
250
25
0.81
1.23
9.3
100
10
0.913
1.10
9.5
50
5
0.95
1.05
9.6
-
0
1
1.00
-
Effetto della [B] sulla cinetica
k+B
b
b +k
*[B]
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0
10
20
30
[B] (mM)
40
50
60
[B]=50 mM
to=0.67 ms
[B]=25 mM
[B]=10 mM
[B]=5 mM
[B]=0
Un semplice schema di blocco cont.
Sappiamo inoltre che in assenza di bloccante MOT=1/b quindi,
possiamo ricavare k+B·[B].
Inoltre, possiamo ricavare la costante di dissociazione del bloccante
KD in quanto KD=k-B/k+B (Neher & Steinbach, 1978).
Pertanto, in questo semplice schema tutte e quattro le costanti di
velocità e la KD possono essere determinate dall’analisi dei tempi di
chiusura e di apertura.
Un approccio alternativo è il seguente (Colquhoun & Hawkes, 1983):
Mean open time per burst = Mo· Mr = 1/b
dove Mo=mean OT, Mr= numero medio di aperture per burst
e
Mean closed time per burst = Mc · Mr = CB/b
dove CB = [B]/KD
4
Un canale con due stati chiusi distinti
C2
k +1
k -1
a
C1
O
b
MOT = 1/b
C
MC1T = 1/(a+k-1)
O
burst
burst
MC2T = 1/k+1
E’ Inoltre possibile ricavare che:
il numero medio di aperture per burst MOB=(a/ k-1)+1
il(Colquhoun & Hawkes, 1981)
(Johnston & Wu, Foundations of Cellular Neurophysiology p. 268)
Registrazioni di singolo canale da canali del Ca 2+. Configurazione di cell-attached con la pipetta di patch riempita con
Ba2+. Il bagno contiene una soluzione salina normale.
Risposte a depolarizzazioni di
circa -5 mV (sinistra) e +15 mV
(destra). Nel pannello di destra
il livello di corrente zero è
indicato con linee orizzontali.
Le ampiezze medie di singolo
canale sono 0.9 pA a -5 mV, e
0.6 pA a +15 mV. Filtro passabassi a 1 kHz.
Istogramma dei tempi di
apertura per i dati a -5 mV
(pannello di sinistra di (A).
L’istogramma è stato
interpolato con un singolo
esponenziale la cui
costante di tempo è to =
0.81 ms.
Istogramma dei tempi di chiusura per gli stessi dati a -5 mV .
L’istogramma è stato interpolato con un doppio esponenziale
con costanti di tempo tc = 1.05 ms e ts = 25.5 ms.. tc
rappresenta la durata media delle brevi chiusure all’interno dei
bursts osservabili nel pannello di sinistra di (A). ts rappresenta
il tempo medio tra eventi indipendenti. Il numero medio di
aperture per burst è 0.57.
Our motivation was to learn more about the
mechanisms by which the Ca channel operates.
Correnti di singolo canale (A), e istogrammi dei tempi di apertura, chiusura e latenza (B), calcolati dalle correnti in (A).
Istogramma dei tempi di apertura: interpolato con un
singolo esponenziale (costante di tempo di 1.2 msec).
Istogramma dei tempi di chiusura: la linea continua è
ottenuta dqall’interpolazione con il doppio esponenziale
A1exp(-t/tc1) +A2exp(-t/tc2).
A1/A2 = 4.5 = numero medio di aperture per burst.
Istogramma delle latenze: il picco più alto è a circa
5-6 ms, suggerendo la presenza di una fase di
attivazione.
È prevista cooperatività nell’attivazione dei canali del Na e del K
Equivalente lineare della
cinetica m3 secondo il modello
di H&H
C1
3a


b
0
2a
C2
10


2b
20
C3
30
a


3b
40
O
50
Cooperatività positiva
C1
a


3b
0
2a
C2


10
20
2b
C3
30
3a


b
40
O
50
Entrambi gli schemi predicono lo stesso andamento temporale dell’attivazione (a
livello macroscopico), tuttavia il modello di destra non è più interpretabile come
l’apertura di tre gates m identiche e indipendenti. Piuttosto, esso potrebbe essere
interpretato come un’attivazione con cooperatività positiva in cui ciascuna gate è più
facile da aprire della precedente.
5
Un semplice schema di attivazione da agonista
k +1
A+R
a
AR
k -1
b
AR*
(open)
MOT = 1/b
Il tempo di chiusura sarà la somma dei tempi trascorsi negli stati A e
AR:
MCT = 1/(a+k-1) + 1 /(k+1·[A])
Questo potrà essere separato in due componenti di tempi di
chiusura se le costanti di velocità sono significativamente differenti.
Tempo medio in AR (chiusure dentro i burst) = 1/(a+k-1)
Tempo medio di chiusura tra i burst) = 1/(k+1·[A])
MOB= a/k-1 + 1
Bibliografia
1. Colquhoun & Hawkes (1977) Proc R Soc Lond [Biol]
199:231-262.
2. Colquhoun & Hawkes (1983) in Single channel
recording eds. Neher & Sakmann, Chapter 9.
3. Neher & Steinbach (1978) J Physiol 277:153-176.
FINE