CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 3
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’
RNA, trascritto primario
TRASCRIZIONE
MODIFICAZIONI
TP
Capping e poliadenilazione
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
Modificazioni post-traduzionali
TRADUZIONE
ESPRESSIONE GENICA
Trascrizione (trascrittoma)
Il trascrittoma è mantenuto dalla cellula madre alla cellula
figlia ed è modificato a seconda degli stimoli esterni
Traduzione (proteoma)
Contenuto di RNA in cellula eucariota 20-30 pg – 1% dell’intera cellula
0,05-01 pg in cellule batteriche)
TOTAL RNA
CODING 4%
transcriptome
PRE-mRNA
mRNA
NON CODING 96%
Pre-rRNA Pre-tRNA snRNA snoRNA scRNA
rRNA
tRNA
PRE-mRNA
END MODIFICATIONS
mRNA
FUNCTIONS
- CAP
Transport to cytoplasm, initiation of translation
- polyA
Termination transcription, init transl, turnover
Splicing
No role other than removal of introns
Alternative splicing
Enables one RNA to code for two proteins
RNA editing
Enables one RNA to code for two proteins
Converts abbreviated transcripts in functional
RNAs
Places termination codons in some mitoch
mRNAs
5'-Capping
Capping occurs shortly after transcription begins.
m7G is linked to the first nucleotide by
a special 5'-5' triphosphate linkage.
In most organisms, the first nucleotide
is methylated at the 2'-hydroxyl
of the ribose.
In vertebrates,
the second nucleotide is also methylated.
3'-Polyadenylation
A stretch of adenylate residues are added to the 3' end. The poly-A tail
contains ~ 250 A residues in mammals, and ~ 100 in yeasts
Polyadenylation at the 3' end. The major signal for the 3' cleavage is the sequence
AAUAAA. Cleavage occurs at 10-35 nucleotides downstream from the specific sequence.
A second signal is located about 50 nucleotides downstream from the cleavage site.
This signal is a GU-rich or U-rich region.
MATURAZIONE DEL TRASCRITTO PRIMARIO
O EXCISIONE (SPLICING) DEGLI INTRONI A
FORMARE RNAm
ESISTONO QUATTRO CLASSI DI INTRONI :
• INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I
• INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO II
• INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO
DELL’APPARATO DI SPLICING (Spliceosomal Introns)
• INTRONI tRNA Nucleare che subiscono matutrazione per
via enzymatica
Tom Cech
Sidney Altman
Tom Cech e Sidney Altman hanno
ricevuto il premio Nobel per la
Chimica ne 1989 per la scoperta del
meccanismo di self splicing in
Tetrahymena e per la scoperta che la
componente catalitica della
ribonucleasi P responsabile per la
maturazioen del tRNA in E.coli era
una molecola di RNA.
INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I
1. Nucleophilic attack by the 3' OH group of a free guanine nucleoside
on the 5' phosphorus atom at the 5' end of the intron.
2. The 3'OH group at the 3' end of the upstream exon carries out a nucleophilic
attack on the phosphorus atom at the 5' end of the downstream exon.
INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I
In questa classe di introni che comprende l’introne di
rRNA di Tetrahymena lo splicing dipende dalla
struttura terziaria della molecola.
Perché avvenga il “self-splicing” Even though we often
think of them as singlela molecola di RNA deve avere
una struttura secondaria e terziaria ben definita;
alcune variazione sono consentite ma solo se i
cambiamenti mantengono i siti di splicing 3’ e 5’ molto
prossimi l’uno all’altro e la guanosina catalitica nelle
immediate vicinanze.
Introni I tipo
Introni I tipo
MECCANISMO DI EXCISIONE INTRONI DI TIPO II
1° reazione di transesterificazione
promossa da C 2’ adenosina
Rottura legame fosfodiestereo
Formazione nuovo legame 5’-2’ che lega
primo nt con adenosina interna
Formazione del lariate e riformazione del
legame fosfodiestereo
Sequences, secondary structure and tertiary interactions of group II intron bI1 from yeast mitochondria
Black boxes, exon sequences; continuos line, six major intron domains (D1-D6); 5’GUGAG...AU3’,
consensus nucleotides at the intron boundaries.
Red line, ID3 subdomain; dashed red lines, interactions of ID3 with intron and exon sequences,
(EBS1/IBS1 and a-a´).
Marked in blue, individual nucleotides and structures involved in tertiary interactions (EBS2-IBS2, e-e´, dd´, g-g´ and z-z´). Note, for bI1 the d-d’ interaction (U-U) is not established.
Introni self-splicing di gruppo II
I prodotti di razione sono la molecola di RNA
correttamente maturata e un introne che
forma una struttura detta lariate.
Come per gli introni di gruppo I anche per
questa classe di introni una corretta struttura
secondaria e terziaria è indispensabile per lo
splicing.
IN CONCLUSIONE LE DIFFERENZE TRA INTRONI DI
GRUPPO I E II SONO:
• L’AGENTE RESPONSABILE DELL’ATTACCO
NUCLEOFILO INIZIALE.
Spliceosomal Intron Splicing
I passaggi di base necessari per la maturazione di RNAtrascritto primario in eucariote sono gli stessi visti per il
gruppo II di introni self-slicing e i prodotti di reazione
anche in questo caso sono l’RNA maturato correttamente
e un lariate.
A differenza degli introni self-splicing la reazione in
eucariote richiede la partecipazione di un sistema
elaborato di altri fattori quali le small nuclear
ribonucleoprotein particles or snRNPs.
Ogni snRNP è un complesso di diverse proteine e piccoli
U-RNA detti small nuclear RNA or snRNA. Gli snRNA
coinvolti nello splicing sono cinque
INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO
DELL’APPARATO DI SPLICING
5’
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 1
3’
5’
3’
5’
3’
Commitment complex (E complex)
U1 lega il sito di taglio in 5’ e U2AF lega
il sito polipirimidinico
Complex A U2 lega il sito “branch”
Complex B si associano U5, U6, U4
Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 2.
Riposizionamento, U1 si dissocia,
U5 si associa all’introne; U 6 lega
il sito di taglio in 5’
Complex C U4 si dissocia,
U6 e U2 catalizzano la
transesterificazione
U5 l’esone al sito di taglio in 3’
Avviene il taglio in 5’ e si forma il lariate
Avviene il taglio in 3’ e la ligazione
Tra gli esoni
LE SEQUENZE DI SPLICING SONO CONSERVATE NEI VERTEBRATI
5’ splice site: 5’-GU-3’
Tratto polipirimidinico
3’ splice site 5’-AG-3’
Esistono introni AU-AC sono simili a introni GU-AG ma richiedono
Un apparato di splicing differente
RNA EDITING
Modificazioni enzimatiche tramite
cui nucleotidi di RNAm
vengono modificati
RNA EDITING
•Editing by deamination
•Editing by insertion or deletion
RNA EDITING
RNA editing: specific nucleotides are modified to change one nucleotide into another.
One example is the de-amination of cytidine which occurs in mammalian apolipo protein
B mRNA in the intestine.
Here, a specific C is changed into a U, introducing a stop codon for translation and
thereby a shorter version of the protein.
A second example is de-amination of adenosine to inosine. Inosine is read as guanosine by the
translation machinery. The adenosine is present in a double stranded region of the mRNA and
the enzyme adenosine de-aminase that acts on RNA, ADAR, catalyzes the reaction. Examples
of mRNAs edited by ADAR are mRNA encoding glutamate receptors, serotonin receptors and
potassium channels in the central nervous system and hepatitis delta virus RNA.
GUIDE RNA
The mitochondria for some trypanosome protozoa
undergo gRNA-directed mRNA editing. The gRNA
identifies particular sequences and directs the
insertion or deletion of uridylates (U) from the
mRNA by enzymes residing in a macromolecular
complex. The edited portion of the mRNA is in the
coding region, which has the effect of modifying
the protein that is produced.
ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI
3’
RNA, trascritto primario
TRASCRIZIONE
MODIFICAZIONI
TP
Capping e poliadenilazione
Splicing o maturazione
Fuoriuscita dal nucleo
riconoscimento da parte dei ribosomi
traduzione
Modificazioni post-traduzionali
TRADUZIONE
TRADUZIONE DI mRNA IN PROTEINE
CELLULE EUCARIOTE
MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DI PROTEINE
Proteolisi
Glicosilazione
Acilazione metilazione
Fosforilazione
Sulfunilazione
Prenilazione