Elementi trasponibili
Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del
cromosoma
sito donatore
sito accettore
Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione
genomica, per la trasposizione non c’è nessuna omologia tra le
sequenze del sito donatore e accettore
GATCA
CTAGT
sito bersaglio
GATCA
CTAGT
GATCA
CTAGT
ripetizioni dirette del sito bersaglio
Gli elementi IS
Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine
necessarie alla propria trasposizione.
Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi
IR
210 bp
InsA
273 bp
InsB
IR
768 bp
IR
Trasposasi
IR
IS1
{
E.coli
3-12
Shigella 30-40
Serratia 2
IS2, IS3, IS4, IS5
lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bp
lunghezza media IR: 10-25 bp
Trasposoni composti
IR
IR
altri geni
lunghezza
(bp)
Tn3
Tn501
Tn951
Tn5
Tn9
Tn10
Tn1681
4957
8200
16500
5700
2500
9300
2061
IR
sequenza IS
sequenza IS
trasposone
IR
modulo
terminale
IS50
IS1
IS10
IS1
marcatori genetici
Amp
Hg
Utilizzazione lattosio
Kc
Cm
Tet
Enterotossina stabile
al calore
Origine dei trasposoni composti
trasposizione in un sito adiacente
IS
IS
1 o più geni batterici
Formazione di sequenze ripetute dirette
nel sito bersaglio di un trasposone
GGGTTTCCAAA
CCCAAAGGTTT
La trasposasi induce tagli
sfalsati nel sito bersaglio
GGGTTTCCAA
C
A
CCAAAGGTTT
Formazione di sequenze ripetute dirette
nel sito bersaglio di un trasposone
inserzione del trasposone
GGGTTTCCAA
C
A
CCAAAGGTTT
riempimento delle interruzioni
G GGTTTCCAA
C CCAAAGGTT
GGTTTCCAA A
CCAAAGGTT T
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore
DNA
mRNA
proteina
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore
DNA
mRNA
proteina assente o tronca
Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto “polare”
P
gene 1
gene 2
gene 3
mRNA
policistronico
P
Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione è bloccata
dall’ elemento trasponibile
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Attivazione di geni silenti
promotore
debole
DNA
gene non trascritto o scarsamente trascritto
promotore
forte
gene altamente trascritto
Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso l’esterno
L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
I trasposoni svolgono un ruolo importante nel movimento dei geni per la
resistenza agli antibiotici e altri geni da un genoma a un plasmide e viceversa
Il gene ampC di K. pneumoniae codifica per una b-lattamasi
promotore
debole
ampC
Il ceppo iniziale di Klebsiella era poco resistente ai beta-lattamici poichè il
gene ampC era scarsamente trascritto
L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
Sotto la selezione degli antibiotici il gene ampC ha acquisito due sequenze
IS con il risultato di essere maggiormente trascritto conferendo un livello
di resistenza clinicamente significativo
promotore
forte
IS
ampC
IS
Il risultante trasposone è stato capace di muovere ampC in un plasmide
coniugativo, oggi diffuso a molti ceppi di Klebsiella
Quello che un tempo era un gene di resistenza clinicamente irrilevante è
diventato il terrore degli ospedali – tutto grazie alle IS
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
X
delezione
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
a
b
c
d
b
a
X
d
c
inversione
a
c
b
d
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
fusione di repliconi
formazione del
cointegrato
il trasposone Tn3
sito di risoluzione del
cointegrato
tnpA
trasposasi
sequenza ripetuta invertita
di 38 bp
tnpR
bla
resolvasi b-lattamasi
Un virus trasponibile: il batteriofago Mu
E’ un virus temperato
In seguito ad infezione, il suo DNA si integra in siti distribuiti
casualmente sul cromosoma
Tra i batteri lisogeni si osservano mutanti dovuti all’inattivazione
per integrazione del profago
Si replica mediante trasposizione (una nuova copia del DNA virale
è inserita in un punto diverso del cromosoma batterico)
Come i trasposoni è in grado di promuovere riarrangiamenti del
materiale genetico (delezioni, inversioni, fusione di repliconi ecc.)
La mappa genetica del fago Mu
geni della testa e della coda
immunità
c AB
integrazione
replicazione
C
regione G
invertibile
Il plasmide di resistenza R1
Gli elementi trasponibili sono responsabili dell’integrazione del fattore F
G
H
S D
I
IS3
gd
F
IS3
C
B
F
K
94 Kb
E
L
A
J
oriT
inc, rep
IS2
L’adattamento dei batteri
Strategie di adattamento
mutazione
trasferimento genico
orizzontale
regolazione dell’espressione genica
regolazione della trascrizione
regolazione della traduzione
regolazione post-traduzionale
RNA polimerasi e inizio della trascrizione
regione -35
T82T84G78A65C54A45
regione -10
T80A95T45A60A50T96
RNA polimerasi
Complesso proteico di 480.000 D costituito da 5 subunità:
Nucleo enzimatico
a2bb’
a2bb’s
Fattore sigma
s
Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo
di DNA, ma non è in grado di iniziare la trascrizione al sito corretto.
Il fattore sigma è responsabile del corretto riconoscimento del
promotore. Viene rilasciato appena inizia la trascrizione.
Fattori sigma alternativi e regolazione
globale dell’espressione genica
Subunità sigma
Geni trascritti
Segnale
in E. coli
s 70
maggior parte dei geni
s 32
geni heat-shock
temperatura elevata
s 55
geni regolati dall’azoto
carenza di ammonio
s 38
geni da stress ossidativi
agente ossidante
Ogni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche
sequenze consensus -35 e -10.
La sporulazione in Bacillus subtilis
e i fattori sigma alternativi
La sporulazione rappresenta un drastico cambiamento dello stile di
vita del batterio
La transizione da una fase all’altra si realizza attraverso
cambiamenti globali dell’espressione genica mediati da fattori sigma
alternativi
Subunità sigma
Geni trascritti
s 43
fase vegetativa
s 32
inizio sporulazione
s 29
inizio sporulazione (fase II)
gp28
sporulazione intermedia
gp33-34
fasi finali della sporulazione
Terminazione Rho-indipendente
5’-A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U-U-U-U-U-U-U-3’
regione ricca in GC
serie di U
la polimerasi continua la trascrizione
terminatore
la polimerasi termina la trascrizione
Terminazione Rho-dipendente
L’operone lac
I
P O
Z
Y
A
DNA
mRNA
proteine
Geni strutturali
lacZ: b-galattosidasi
lacY: b-galattoside permeasi
lacA: b-galattoside transacetilasi
mRNA policistronico
regolazione coordinata: tutti i geni si esprimono all’unisono
Il gene regolatore lacI codifica per la proteina regolatrice
(repressore)
Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa
di un substrato specifico
Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole
di b-galattosidasi (<5)
In presenza di lattosio , nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate
fino a 5000 molecole di b-galattosidasi (5-10% delle proteine totali)
glucosio
galattosio
La molecola che causa la produzione dell’enzima capace di
lattosio
metabolizzarla
è chiamata induttore
La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole
strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della bgalattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa
caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG)
Se l’induttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca
I
P O
repressore
RNApolimerasi
Z
Y
A
Il repressore previene la trascrizione
legandosi a una sequenza di DNA chiamata
operatore.
L’operone lac è sottoposto a regolazione negativa
In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione
dei geni strutturali.
La proteina regolatrice prende il nome di repressore
In che modo l’operone lac risponde all’induttore?
I
P O
Z
Y
A
induttore
Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame
all’operatore e il secondo per il legame dell’induttore
Quando il repressore lega l’induttore subisce una modificazione
conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito
operatore (esempio di controllo allosterico)
Mutazioni a carico dell’operatore
I
P O
Z
Y
A
repressore
Mutazioni nel gene O (Oc) portano all’espressione costitutiva dei
geni strutturali: vengono trascritti in assenza dell’induttore
Costitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di
crescita
Mutazioni a carico del repressore
I
P O
Z
Y
A
repressore
Mutazioni nel gene I (Ic), a carico del sito di riconoscimento
dell’operatore, portano all’espressione costitutiva dei geni
strutturali
Mutazioni a carico del repressore
I
P O
Z
Y
A
induttore
repressore
Mutazioni nel gene I (IS), a carico del sito di riconoscimento
dell’induttore, sono responsabili della super-repressione: i geni
strutturali non vengono più indotti in presenza dell’induttore
Un altro sistema di regolazione negativa:
la tossina di Corynebacterium diphtheriae
La tossina viene prodotta quando il livello di ferro nella gola è basso
gene
regolatore
P O
geni per la tossina
trascrizione e produzione della tossina
repressore
ferro
La molecola effettrice (il ferro) non è un induttore bensì un co-repressore
Un sistema in cui la molecola effettrice coopera con il repressore per
bloccare la trascrizione è definito reprimibile
La regolazione positiva dell’espressione genica
Nel controllo positivo, la proteina regolatrice promuove il legame
della RNA-polimerasi al promotore
gene
regolatore
“activator binding site”
P
gene1
gene2
gene3
attivatore induttore RNApolimerasi
L’attivatore non si lega al DNA in assenza dell’induttore
ABS
P
trascrizione
P
ABS
P
trascrizione
ABS
P = promotore
ABS = activator binding site
Il regulone
Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della
stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono
implicati nello stesso pathway
Il regulone del maltosio è sotto controllo positivo
gene
regolatore
attivatore +
maltosio
“activator binding site”
P
maltosio
gene1
gene2
gene3
Il regulone per la biosintesi dell’arginina
Gene o operone
arg A
arg B-C-E-H
arg D
arg F
arg G
localizzazione
60 min
88 min
72.5 min
6 min
68 min
Esempio di regulone sottoposto a controllo negativo: tutti i
geni per la catena biosintetica dell’arginina sono regolati da
un repressore
Sistemi di controllo globale dell’espressione genica
Un batterio può regolare molti geni diversi simultaneamente in
risposta a cambiamenti ambientali. Spesso più operoni o reguloni
diversi possono essere attivati o disattivati
Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della
stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono
implicati nello stesso pathway
Se geni e operoni appartengono a pathway differenti si parla di
moduloni
ESEMPI:
regolazione mediante fattori sigma alternativi
risposta SOS
repressione da catabolita
Fattori sigma alternativi e regolazione
globale dell’espressione genica
Subunità sigma
Geni trascritti
Segnale
in E. coli
s 70
maggior parte dei geni
s 32
geni heat-shock
temperatura elevata
s 55
geni regolati dall’azoto
carenza di ammonio
s 38
geni da stress ossidativi
agente ossidante
Ogni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche
sequenze consensus -35 e -10.
Repressione da catabolita
Quando un batterio cresce in un mezzo contenente glucosio
come risorsa di energia, la sintesi di enzimi catabolici non
correlati viene inibita
In presenza di diverse fonti di energia, il batterio sceglie per
prima quella più facilmente utilizzabile
Gli enzimi per il catabolismo del glucosio sono costitutivi
Circa 300 geni di E. coli sono regolati mediante repressione
da catabolita
La crescita diauxica
Crescita in un terreno
contenente glucosio e
lattosio
Densità batterica
esaurimento
del glucosio
il glucosio inibisce la
sintesi di b-galattosidasi
durante la fase di latenza
viene espresso l’operone lac e
sintetizzata b-galattosidasi
induzione
bgalattosidasi
Il tasso di crescita può
variare
0
1
2
Tempo (ore)
3
4
La molecola effettrice della repressione da catabolita è AMP ciclico
AMP ciclico
O
ATP
Adenilato ciclasi
HO-P=O
CH2
H
Adenina
O
H
H
O
OH
OH
Il glucosio inibisce l’attività dell’adenilato ciclasi e il livello di cAMP
L’operone lac è regolato positivamente da CAP
CAP binding site
I
P O
Z
Y
A
cAMP
CAP
CAP attiva
Ognuno degli operoni che CAP controlla è anche sotto il
controllo di una proteina regolatrice specifica
L’attenuazione della trascrizione
L’operone triptofano
trpR
P
O
trpE
trpD
trpC
trpB
trpB
repressore
attivo
repressore
inattivo
triptofano
L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal
gene trpR
Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e
bloccando la trascrizione
L’attenuazione della trascrizione
L’operone triptofano
trpR
P
O
trpE
trpD
trpC
trpB
trpB
leader
162 nt
codoni trp
1
2
peptide leader (14AA)
3
4
attenuatore
mRNA
1
1
2
2
3
4
3
4
mRNA
Attenuatore
(terminatore della
trascrizione)
UUUUUUU
Se al segmento 1 viene impedito di
appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo
si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane
singolo e non si forma il terminatore
2
1
3
4
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide
leader regola l’attività della RNA polimerasi
peptide leader
1
AUG
UGA
2
3
4
mRNA
Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader
arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli
l’appaiamento con il segmento 3
3
AUG
1
UGA
2
4
La polimerasi continua
3
2
La polimerasi termina
la trascrizione
2
3
4
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide
leader regola l’attività della RNA polimerasi
peptide leader
AUG
1
UGA
2
3
4
mRNA
Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà
in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti
impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2.
Il segmento 2 si associa con il segmento 3
2
AUG
1
UGA
3
4
Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la
velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la
disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica.
Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA
polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la
sequenza dell’attenuatore.
La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la
riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operani
insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.
Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione
della biosintesi di molti amminoacidi
Prescott pag. 262
Regolazione traduzionale
Operone per le tossine batteriche
La proteina A entra nella cellula e provoca il danno
La proteina B si lega al bersaglio (cellula umana)
Due geni di un singolo operone possono essere tradotti in quantità diverse
Rbs = “ribosome binding site” (Shine-Dalgarno) 5’-AGGAGG-3’
Regolazione post-trascrizionale mediante RNA antisenso
L’RNA antisenso ha una sequenza complementare a una molecola di mRNA.
Il legame dell’RNA antisenso può bloccare la traduzione dell’ mRNA.
Sistema host cell killing del plasmide R1
Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura
il mantenimento del plasmide all’interno di una popolazione batterica
hok mRNA: emivita 20 min
hok
SD
128 bp
sok
sok mRNA: emivita < 1-2 min
La risposta all’osmolarità in E. coli
EnvZ
OmpC
OmpF
OmpR
sintesi di OmpC
174 b
mRNA per OmpF
micF RNA
Regolazione post-traduzionale
modificazione
allosterica
Controllo tipico della
via biosintetica degli
amminoacidi
Un enzima della catena può legare il prodotto finale che funziona da inibitore
Se il prodotto finale viene sintetizzato in eccesso o se diventa disponibile
nell’ambiente, non è più conveniente per il batterio continuare a sintetizzarlo
Questo tipo di controllo è anche definito inibizione a feedback