LA MULTIPLEX-LIGATION DEPENDENT
PROBE AMPLIFICATION (MLPA) COME
NUOVA TECNICA PER LO STUDIO
MOLECOLARE DEL MELANOMA
CUTANEO
L. Schirosi, N. Bigiani, G. Sartori, S. Bettelli, L. Garagnani, M. Masini,
M. Gozzoli, A. Maiorana
Dipartimento integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di
Medicina Legale, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia,
Modena
INTRODUZIONE
• Il melanoma cutaneo (MC), sebbene
rappresenti solo il 4% di tutti i tumori
cutanei, è la causa del maggior numero di
decessi correlati ai tumori della pelle.
• La diagnosi precoce, un’accurata valutazione
prognostica e la scelta di un trattamento
terapeutico mirato sono essenziali per
aumentare il tasso di sopravvivenza.
• Ciò, tuttavia, è reso ulteriormente difficile dal
fatto che alla base di tale neoplasia esistono
complessi meccanismi eziopatogenetici che
impediscono
una
chiara
e
precisa
identificazione delle alterazioni molecolari
responsabili della tumorigenesi e dello
sviluppo di metastasi.
• Tra le principali anomalie riscontrate a livello
cromosomico, quelle più frequenti sono a
carico del locus genico 9p21, che risulta
deleto in circa il 20% dei MC, a livello del
quale mappano diversi geni che hanno azione
di oncosoppressori.
• Tra questi:
- CDKN2A che codifica sia per la proteina
INK4a (p16) che per ARF (p14),
- CDKN2B (p15),
- MTAP (metiltioadenosina fosforilasi) che
codifica, invece, per un enzima coinvolto
nella sintesi delle poliamine.
• Non è ancora particolarmente conosciuta
l’eventuale implicazione terapeutica della
delezione di questi geni, tuttavia è stato
dimostrato che la perdita di funzione
dell’enzima MTAP possa compromettere lo
stato di risposta alla terapia con interferone.
SCOPO
• Il presente studio è stato svolto con
l’obiettivo di riuscire a caratterizzare in modo
preciso le alterazioni del numero di copie dei
principali geni situati nel locus 9p21, in un
piccolo gruppo di MC, avvalendosi di una
recente tecnica di biologia molecolare, la
Multiplex - Ligation dependent Probe
Amplification (MLPA).
METODI
• Sono stati analizzati 19 casi di MC, fissati in
formalina ed inclusi in paraffina, con il Kit
SALSA MLPA P024 9p21 (MRC Holland) che
consente di indagare l’alterazione del
numero di copie di 39 sequenze di acido
nucleico in una singola reazione, di cui 24
corrispondono ai principali geni del locus
9p21 (tra cui CDKN2A, CDKN2B e MTAP).
• Questo metodo si basa sull’ibridazione di
sonde specifiche con le corrispondenti
sequenze di DNA genomico, seguita poi da
una PCR multiplex delle sonde ibridizzate e
successiva analisi semiquantitativa dei
prodotti di amplificazione.
(http://www.mlpa.com)
RISULTATI
• 6 casi su 19 sono risultati alterati. In
particolare:
- 2 casi presentano la delezione del gene
CDKN2A,
- 1 caso è deleto sia per il gene CDKN2A che
CDKN2B
- 3 casi evidenziano contemporaneamente la
delezione dei geni CDKN2A, CDKN2B e
MTAP.
CONTROLLO
CAMPIONE
Delezione (nel campione
rispetto al controllo) del
picco corrispondente al
gene CDKN2A
Delezione (nel campione
rispetto al controllo) del
picco corrispondente al
gene CDKN2B
Delezione (nel campione
rispetto al controllo) del
picco corrispondente al
gene MTAP
CONCLUSIONI
• Questa tecnica risulta di facile applicazione,
grazie anche all’utilizzo di pochi ng di DNA
(50-200 ng), fornisce in una singola reazione
informazioni sull’assetto di più geni in tempi
brevi (48 ore) e con costi contenuti.
• Per queste caratteristiche, l’MLPA appare una
metodica
ottimale
per
ottenere
una
caratterizzazione dettagliata del locus 9p21
nei MC.
• Se validata da uno studio retrospettivo, la
conoscenza, in modo così fine, della
combinazione di tali alterazioni molecolari
può essere sicuramente d’ausilio al clinico
nell’effettuare una valutazione prognostica
migliore della neoplasia per ogni singolo
paziente, accompagnata da una scelta mirata
del trattamento terapeutico.