Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
•
Le molecole cariche interagiscono con gruppi funzionali
presenti sulla fase stazionaria
•
La forza del legame proteina-matrice dipende dalla carica
netta della proteina
•
La separazione si basa sulle differenze di carica netta (per
valori di pH definiti) delle diverse proteine
•
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
•
Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa,
destrano ed agarosio
solida – gruppi carichi
liquida
Si basa sull’attrazione elettrostatica esistente tra
proteine cariche e GRUPPI IONICI di carica
opposta presenti sulla MATRICE
Scambiatore cationico
Scambiatore anionico
Il meccanismo dello scambio ionico è definito in termini di
cinque passaggi distinti:
 Diffusione dello ione sulla superficie di scambio
 Diffusione dello ione all’interno della matrice fino al sito di scambio
 Scambio degli ioni al sito di scambio
 Diffusione dello ione che è stato scambiato sulla superficie dello scambiatore
 Distacco selettivo della molecola di interesse
1. Variazioni di pH e/o di forza ionica
2. Eluizione per affinità → è introdotto nel sistema uno ione che presenta
affinità maggiore per lo scambiatore rispetto allo ione legato
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
-
-
-
-
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
-
-
CENTRIFUGAZIONE
-
Scambiatore
Proteine con carica +
Proteine con carica -
-
-
-
- -
-
-
Soluzione di lavaggio
-
-
-
- -
-
-
Soluzione salina concentrata
-
-
-
- -
-
-
Eluizione
-
-
-
-
-
-
-
-
_
_
_ _
_
_
R-CH2-COOR-CH2-COO-
+
+
+ +
+
+
R-CH2-COO-
R-CH2
_
_
_ _
-COO-
R-CH2-COOR-CH2-COO-
_
_
+
+
+
ClNa+
R-CH2-COOR-CH2-COOR-CH2-COO-
Na+
Na+
Cl-
+
+
+ +
+
+
Cl- Na+
Na+
Cl-
R-CH2-COOR-CH2
Na+
Na+
-COO-
R-CH2-COO-
Cl-
+
+
Cl+
Cl-
Na+
Cl-
Na+
Na+
Na+
R-CH2
-COO-
Na+
R-CH2-COO- Na+
R-CH2-COO- Na+
R-CH2-COO- Na+
Cl-
Na+
Cl-
Cl-
R-CH2-COO- Na+
Cl-
R-CH2-COO- Na+
ClCl-
Na+
Na+
Cl-
Na+
Cl-
+
+
+ +
+
+
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cromatografia in batch
-
-
-
-
-
-
-
-
Cromatografia su COLONNA
[SALE]
[SALE]
Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo CARBOSSIMETILICO
scambiatore debole di cationi
R-CH2-COOH
=
R-CH2-COO-
pKa ~ 4.5
Gruppo PROPILSOLFONICO
scambiatore forte di cationi
R-CH2-CH2-CH2-SO3H = R-CH2-CH2-CH2-SO3pKa < 1
Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo amminico terziario
scambiatore debole di anioni
R
|
R-CH2-N:
|
R
=
R
|
R-CH2-NH+
|
R
pKa ~ 8.5
Ammina quaternaria
scambiatore forte di anioni
R
|
R-CH2-N+-R
|
R
Effetti del pH sulla carica delle molecole proteiche
pI = 5.5
Proteinan+
Proteinan-
4
7
10
pH
Effetti del pH sulla carica delle molecole proteiche
pI = 8.5
Proteinan+
4
Proteinan7
10
pH

Si definisce capacità totale di scambio il numero di milliequivalenti di ioni
scambiabili, riferito ai grammi di scambiatore secco o all’unità di volume
della resina idratata
 Elettroliti deboli, i quali sono ionizzati a valori estremi di pH, potranno
essere separati solo su scambiatori forti, in grado di operare in un
ampio intervallo di pH
 Per gli elettroliti forti si preferisce ricorrere a scambiatori deboli, i quali non
sono in grado di legare le impurità fornite di carica presenti nel
campione e possiedono caratteristiche di eluizione migliori
 Il pH del tampone adoperato deve essere di almeno una unità inferiore o
superiore al punto isoionico dei composti da separare
•
Scambiatore cationico forte
•
pH 1-2 (tutti gli aa si legano)
•
Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica:
1.
2.
3.
•
aa acidi (es. aspartato e glutammato)
aa neutri (es. glicina e valina)
aa basici (es. lisina e arginina)
Rivelazione tramite ninidrina
VANTAGGI
• Possibilità di caricare grandi volumi
• Eluizione della proteina di interesse in un piccolo volume
SVANTAGGI
• Esecuzione in due tempi
• Eluizione in un tampone a pH e forza ionica diversi dal
tampone iniziale
• Possibilità di selezionare solo molecole ionizzabili
Determinazione della concentrazione proteica
mediante METODO DI BRADFORD
Il colorante Coomassie® Brilliant Blue G-250 nella sua
forma libera presenta un massimo di assorbimento a 465
nm (marrone) → il legame alle proteine determina uno
spostamento del massimo di assorbimento del colorante a
595 nm (blu)
La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla
quantità di proteine presenti nel campione in esame
L’incremento di assorbanza a 595 nm (intensità del colore
blu) è proporzionale alla concentrazione proteica
COSTRUZIONE DI UNA RETTA DI TARATURA
 Proteina a concentrazione nota (BSA)
 Colorante (Bradford)
1 mg/ml
2 mg/ml
4 mg/ml
8 mg/ml
16 mg/ml
Camp. H20 Camp.
µl
µl
Bianco 500
Bradford
µl
Abs 595 nm
M
--
500
0,423 0,453 0,438

1
499
1
500
0,598 0,639 0,619 0,181
2
498
2
500
0,68
4
496
4
500
0,796 0,811
8
492
8
500
1,001 0,998 1,000
0,684 0,682 0,244
0,804 0,366
0,56
µg/ml
y = 0,0511 x
0,45
Assorbanza a 595 nm
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
2
4
m g di proteina
6
8
Camp.
H2 0
µl
Bianco
500
1
499
2
Camp.
µl
Bradford
µl
Abs 595 nm
M

500
0,423 0,453 0,438
1
500
0,598 0,639 0,619 0,181
498
2
500
0,68
4
496
4
500
0,796 0,811 0,804 0,366
8
492
8
500
1,001 0,998 1,000
pool
490
10
500
#1
490
10
500
#2
490
10
500
#3
490
10
500
#4
490
10
500
0,684 0,682 0,244
0,56
µg/ml
Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE
 Si basa sulla specificità delle interazioni biologiche per ottenere la
separazione e la purificazione delle molecole
 Un ligando specifico per la molecola di interesse è legato
covalentemente ad una matrice insolubile
 E’ necessario che le molecole da isolare siano in grado di legare il
ligando in maniera specifica e reversibile
 FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
solida – ligando immobilizzato
liquida
• Deve possedere un numero sufficiente di gruppi chimici, ai quali
possa essere legato covalentemente lo specifico ligando
• Deve essere stabile nelle condizioni di legame e durante la
successiva eluizione
• Deve interagire solo debolmente con le altre macromolecole,
riducendo così al minimo l’adsorbimento aspecifico
• Le matrici più utilizzate sono i destrani (Sephacryl S), agarosio
(Sepharose, Bio-Gel A), poliacrilammide (Bio-Gel P), polistirene
(Bio-Beads S), cellulosa
 Per evitare che il legame del ligando alla matrice possa interferire con la sua capacità
di legarsi poi alla macromolecola, è preferibile interporre un braccio spaziatore tra
ligando e matrice
 La sua lunghezza è critica per l’efficienza della cromatografia (la lunghezza ottimale è
tra 6 e 8 atomi di carbonio):
1) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligando e la molecola da
purificare
2) Se troppo lungo può instaurare interazioni idrofobiche con le molecole
proteiche
GENERICO: un ligando che mostri una selettività di gruppo, dal momento che
è in grado di legare gruppi affini di molecole che possiedono una
similarità chimica insita molto ampia, ad es. poly-(U) per mRNA
SPECIFICO: un ligando che sia in grado di legare in maniera specifica una
data molecola, ad es. un analogo di un substrato per purificare
un enzima o ioni nickel per code di istidina