Lezione 7-8
mercoledì 4 Marzo 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
vari metodi e kit di estrazione
i kit piu’ utilizzati si basano sull’utilizzo
di matrici silicee: gli acidi nucleici si
legano alle particelle della matrice
differenti tipi di acido nucleico
adsorbono più o meno bene alla matrice
di silice, a seconda della forza ionica e
del pH della soluzione
dopo avere lavato la matrice silicea, gli
acidi nucleici sono eluiti con un tampone
a bassa concentrazione salina o con
acqua e sono pronti per le successive
reazioni
DNA genomico ad alto PM
Dalla lisi alla estrazione:
Estrazione di DNA da piccole quantità di materiale biologico
(sangue, cellule, tampone, siero, bulbo capellifero) Microcon Millipore
operare sotto cappa per mantenere sterilità ed evitare contaminazione
In una provetta eppendorf si mette, a seconda del materiale a disposizione:
-il cotone del tampone orale (swab) con la mucosa bucale (si incide e si asporta il cotone con
una lametta, facendo ben attenzione a cambiare sempre la lama)
siero o sangue (diluito)
altro (estremità del capello con il bulbo, ecc..)
Si aggiungono 300l (su 300l di siero) del tampone di estrazione:
Buffer di estrazione: 100mMTris/Hcl
100mM NaCl
10mM EDTA pH 8,00
2% SDS
e 7,5 l di proteinasi K. ( 20 mg/ml)
Incubare a 56°C o. n.
Agitare e centrifugare (breve spinnata). Nel caso di cotone (tampone-swab) strizzare bene o
centrifugare più a lungo.
Sul supernatant aggiungere 300l di fenolo/cloroformio/alcool isoammilico (25:24:1).
Agitare – mescolare senza vortex fino ad ottenere una emulsione lattacea
Cg 13000 rpm per 3 min.
prendere la fase acquosa evitando l’interfaccia (proteine)
dopo l’estrazione la purificazione
Aggiungere 100 l di H2O sterile a un tubo concentratore Microcon
100 (Millipore costituito da una filtro e da un tubo da 2 ml).
Trasferire la fase acquosa ottenuta dalla centrifugata (contenente il
DNA) sul filtro del tubo
- Cg (centrifugare 2500 rpm per 25 min
- eliminare il liquido filtrato e aggiungere 200 l di H2O
(lavaggio)
- Cg 2500 rpm per 25 min
- trasferire il filtro su un nuovo tubo
- risospendere il DNA in 100 l di ddH2O sterile (è
importante la sterilità dell’H2O soprattutto in questa fase dove il
DNA viene eluito)
- delicatamente invertire il filtro e porlo su una nuova
eppendorf,
centrifugare a 3500 rpm per 5 min
- conservare il DNA eluito a –20 C
Da quantità maggiori di cellule o tessuto
Si parte da un prelievo di sangue di almeno 5-10 ml in EDTA 50mM finale
•ACD 1 ml per 6 ml di sangue
•(acido citrico e glucosio: per 100 ml acido citrico 0.48 gr
citrato sodico
1.32 gr
glucosio
1.47 gr
se sono una decina di milioni di linfociti fare l'estrazione in 4 ml di Tris - EDTA ed il resto in proporzione
-risospendere in 10 ml Tris-HCL 10 mM pH 8.3 ed EDTA 5mM
-si lisano con 1 ml di SDS 10% e 100 microlitri di proteinasi K (10mg/ml) per due o tre ore a 60 gradi,
-poi aggiungere 2 ml NaCL 5 M e si mescola delicatamente.
-aggiungere 1 volume di fenolo cloroformio e mescolare delicatamente 15-20 minuti
-centrifugare Falcon da 50 ml (4 mila rpm 20 minuti) e prendere la fase acquosa (superiore) evitando
l'interfaccia con le proteine lasciando 1-2 ml di fase acquosa
-aggiungere 1 volume di cloroformio / isoamilico 24:1 (4 ml isoamilico e 96 cloroformio) e mescolare
per inversione 15 minuti
-centrifugare (4 mila rpm 20 minuti) prendendo la fase acquosa (superiore) evitando interfaccia
se c'e' ancora molta zozzeria al''interfaccia ripetere un cloroformio
- aggiungere 2 volumi di alcohol etilico freddo oppure 1 vol. isopropilico
-se si forma la nuvoletta di DNA precipitato, prenderla con una pipetta da 1 ml a punta tagliata a becco
di flauto e trasferirla in una eppendorf da 2 ml sterile (se c’è la nuvola sono almeno 10  di DNA alto PM)
- aggiungere 1.5 ml di alcohol 80%
centrifugare e buttare il sopranatante
-aggiungere 1 ml di alcohol 80% per conservare il DNA pronto per il trasporto
estrarre RNA
Facile ma delicato = degradabile
Una tipica cellula di mammifero contiene circa 20-30 picogrammi
di RNA.
La popolazione di RNA cellulari è molto eterogenea:
RNA totale :
•RNA codificante (~4%)
Comprende le molecole di mRNA citoplasmatico e i precursori
nucleari
•RNA non codificante (~96%)
- RNA ribosomiali con i relativi precursori, che costituiscono fino
all’80% dell’RNA totale
- tRNA e altri piccoli RNA a localizzazione nucleare, nucleolare o
citoplasmatica
vincere contro le RNasi
- le DNasi richiedono ioni metallici per la loro attività e sono
termolabili, per cui sono facilmente inattivate da agenti chelanti e
dalla sterilizzazione in autoclave
- le RNasi non hanno bisogno di cofattori, resistono a trattamenti
drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono
attive entro un ampio range di pH.
- o sono più antiche o ce ne è maggior bisogno
- l’RNA è a basso peso molecolare e si può agitare anche in vortex
metodi diversi di estrazione
- Fenolo acido ed a 45°C (temperatura non troppo alta perché è
instabile incendiabile e può scoppiare)
- guanidina isotiocianato
- derivati di guanidio con fenolo e cloroformio (Trizol della
Invitrogen)
- resine per arricchimento Sigma con oligo dT per legare mRNA
polyAAA
- colonnine di silicio per purificazione Qiagen:
*for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast
* Fast procedure delivering high-quality total RNA in minutes
* Ready-to-use RNA for high performance in any downstream application
* Consistent RNA yields from small amounts of starting material
* No phenol/chloroform extraction, no CsCl gradients, no LiCl or ethanol
precipitation
accorgimenti e sterilità
•Tamponi e soluzioni di uso comune che se utilizzati senza opportune precauzioni,
possono ospitare batteri o altri microrganismi che rilasciano i loro enzimi; autoclavarli
non inattiva le RNasi, anzi può introdurle nei reagenti, per es. liberandole dai corpi
batterici contaminanti.
•lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e cellulari
•batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie delle soluzioni, portando
con sè RNasi
•Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensato soluzioni di Rnasi, solo
materiale monouso sterile plastico
E’ importante quindi :
Dividere le soluzioni in piccole aliquote
Utilizzare plastica garantita RNasi-free
Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C
Indossare sempre guanti e cambiarli spesso
Mantenere un’area di lavoro separata, dedicata all’RNA, con
dotazione di pipette, puntali, provette, reagenti e tamponi esclusivi. Ciò è
importante particolarmente, se nelle stesso laboratorio si usa RNasiA per estrazione di
DNA.
protezione per RNA in soluzione
2-mercaptoetanolo, un agente riducente in grado di rompere i ponti disolfuro
delle proteine
Temperatura: lavorare mantenendo le provette in ghiaccio è un modo di inibire
le ribonucleasi
•Sostanze deproteineizzanti: fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K
RNase inhibitors: RNAsin proteine di origine umana (placenta) o non umana
(E. coli ricombinante), che si legano in modo non covalente alle RNasi e ne
inibiscono così più del 90% dell’attività.
DEPC (dietilpirocarbonato): un agente che reagisce con le proteine
determinando la perdita dell’attività enzimatica (tossico e cancerogeno).
Rnasin inhibitor di RNAsi
RNasin® Plus RNase Inhibitor
RNasin® Plus RNase Inhibitor is a recombinant mammalian
RNase inhibitor that is expressed as a soluble protein in E.
coli, allowing easy purification through a combination of ion
exchange and hydrophobic interaction chromatography. The
protein is capable of inhibiting eukaryotic RNases (e.g.,
RNase A and RNase B) similarly to human placental RNase
inhibitor. RNasin® Plus RNase Inhibitor is tested in RT-PCR
and is compatible with enzymes such as AMV (avian mieloblast.
Virus), M-MLV (Moloney leuk virus) and ImProm-II™ Reverse
Transcriptases or Taq and Tfl DNA Polymerases. RNasin®
Plus RNase Inhibitor also is tested and compatible with
quantitative, real-time RT-PCR
estrazione RNA totale
1)
Metodo della guanidina tiocianato in gradiente di cloruro di cesio
• Colture cellulari o tessuti molli si lisano direttamente.
• Gli altri tessuti si polverizzano in azoto liquido.
(Le RNasi endogene si attivano quando si rompono le cellule!)
•
Lisi cellulare e denaturazione delle proteine (RNasi) sono immediate nella soluzione
di guanidina tiocianato.
•
Aggiungendo detergenti (SDS) e agenti riducenti (DTT) si dissociano i complessi
proteine-acidi nucleici.
•
L’RNA è più denso degli altri componenti cellulari e quindi attraversa il cuscino di
cloruro di cesio.
•
Si perdono i piccoli RNA cellulari: tRNA e rRNA 5S.
• Si ricupera l’RNA dal fondo e si trasferisce in provetta.
• Si precipita l’RNA in etanolo e sali, poi si sospende il pellet di RNA in una soluzione
tampone.
• Si analizza la qualità dell’RNA estratto con spettrofotometro o su gel denaturante
estrazione di RNA con fenolo acido
Il metodo del fenolo acido-guanidina tiocianato (Trizol®) si basa
sull’osservazione che il DNA passa nella fase organica se il
fenolo è tamponato con una soluzione a pH acido 5-6, mentre
l’RNA rimane nella fase acquosa.
Si procede quindi alla precipitazione alcolica in presenza di
cloruro di litio, ammonio acetato o sodio acetato.
Elevate concentrazioni di LiCl
solubilizzano gli RNA di piccole dimensioni (tRNA e 5S RNA)
mentre non solubilizzano quelli di maggiori dimensioni (rRNA e
mRNA), pertanto questi ultimi sono selettivamente precipitati e
raccolti per centrifugazione (flocculano).
arricchire mRNA
La maggior parte degli mRNA eucariotici hanno un poliA all’estremità 3’.
L’mRNA poliadenilato può quindi ibridare con sequenze sintetiche di oligo(dT) (corti
polimeri di desossitimidina), mentre le altre specie di RNA che non ibridano con
l’oligo(dT) possono essere eliminate (non si legano alla resina su colonnina o su
microsfere (beads) di silica.
Questo metodo è adatto per gli mRNA eucariotici, comunque solo una 5%
percentuale dell’ RNA totale è poliadenilato con code di poliA (da siti di
poliadenilazione anche diversi per uno stesso gene).
polyA mRNA
•La preparazione di RNA totale è fatta
passare attraverso una colonna
costituita da un polimero ricoperto
con oligo(dT).
•Solo l’mRNA polidanilato ibriderà
con l’oligo(dT), mentre le altre specie
verranno eliminate mediante lavaggi
con tamponi a bassa concentrazione
salina.
•L’eluato finale sarà costituito dalla
miscela di tutte le specie di mRNA
presenti nella cellula al momento
dell’estrazione.
analisi della qualità dell’RNA
Le preparazioni di RNA totale sono composte prevalentemente di RNA
ribosomiali (80-85% dell’RNA della cellula).
Elettroforesi in gel di agarosio/formaldeide
mRNA = 5% del tot
si vede poco ed è
smearato perché è di
molti pesi molecolari
Agente denaturante: FORMALDEIDE. mantiene l’RNA in forma denaturata. Questo
effetto dura fino a che la formaldeide è presente nel gel o nel tampone.
• Tampone di corsa: poiché l’RNA si idrolizza facilmente a pH alcalino, si utilizzano sistemi
tampone che mantengono il pH del gel intorno ai valori di neutralità (es. MOPS).
Dosaggio, quantificazione
E' possibile dosare gli acidi nucleici con:
1) Metodo Spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto)
2) Metodo Fluorimetrico
3) Metodo Colorimetrico (spettroscopia nel visibile)
metodo spettrofotometrico
Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici
di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento alla
lunghezza d'onda di 260 nm.
Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, per cui è
caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA.
1A260 di DNA a doppio filamento = 50 µg/ml
1A260 di RNA = 40 µg/ml
purezza
Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della
preparazione degli acidi nucleici, perchè le proteine, che sono la
principale fonte di contaminazione, assorbono a 280 nm. Anche
il fenolo legge a 260nm e va eliminato.
Preparazioni pure di DNA con valori di A260/A280 uguali a 1,8
Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali 2
metodo fluorimetrico
In questo caso la concentrazione degli acidi nucleici può essere stimata in base alla
fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.
L’Etidio bromuro è una molecola che si intercala negli acidi nucleici ed emette fluorescenza
rosso-arancio quando eccitata dalla luce UV.
Il dosaggio fluorimetrico è un dosaggio di tipo RELATIVO.
•Quantità crescenti e a concentrazione nota di
acido nucleico vengono caricate su un gel accanto
al campione a concentrazione incognita.
•Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso
in una soluzione di Etidio Bromuro che si
intercala tra le basi dell'acido nucleico rendendolo
fluorescente alla luce UV.
Poiché la quantità di fluorescenza emessa da ciascuna banda osservata è proporzionale alla
massa del DNA presente nella banda stessa, la quantità di DNA nella banda del campione
può essere stimata dal confronto con la fluorescenza delle bande della serie standard.
metodo colorimetrico nel visibile
Il metodo si basa sulla formazione di complessi colorati di particolari sostanze
con il ribosio o con il deossiribosio dello scheletro degli acidi nucleici.
Ci permette di valutare esattamente la quantità di DNA o RNA presenti in
soluzione, anche se la soluzione contiene entrambi gli acidi nucleici.
Orcinolo per l’RNA
Difenilammina per il DNA
L’intenso colore verde-azzurro, che si produce al termine della reazione, consente il
dosaggio colorimetrico dell’RNA a 660 nm.
L’intenso colore blu, che si produce al termine della reazione, consente il dosaggio
colorimetrico del DNA a 595 nm.
Per il dosaggio, è necessario costruire una retta di taratura con soluzioni di RNA o
DNA a concentrazione nota e crescente.