Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Università degli Studi di Bari
Convegno Dairy.it
Cremona, 27.10.2006
Sviluppo di bevande a base di latte
arricchite in peptidi bioattivi
Carlo Giuseppe Rizzello
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Peptidi bioattivi
• Composti presenti in molti alimenti, generati in seguito ad
idrolisi, in vitro o in vivo, di proteine animali o vegetali, aventi
un’attività regolatoria sull’organismo animale, al di là del loro
valore nutrizionale (Meisel, 2001).
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Genesi di peptidi bioattivi
1) Idrolisi gastro-intestinale delle proteine alimentari
- in vivo
2) Nei processi di trasformazione
(materia prima  prodotto finale)
- enzimi naturalmente presenti nel
latte (plasmina)
- chimosina del caglio
- enzimi di origine microbica
- enzimi gastro-intestinali (tripsina, chimotripsina,
pepsina…)
- in vitro, con l’impiego di
- enzimi di origine batterica, fungina e vegetale
- metodi fisici (trattamento al calore; alte
pressioni)
- sintesi chimica
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Proteine del latte: fonte di PB
caseine e siero-proteine contengono peptidi biologicamente attivi
“criptati” all’interno della sequenza-precursore e che possono essere
rilasciati (digestione o processi di trasformazione della materia prima).
Enzimi coinvolti
 proteasi endogene della matrice alimentare
 proteinasi e peptidasi dei microrganismi
 enzimi proteolitici gastro-intestinali
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Quanti mg di peptidi bioattivi possono essere rilasciati
dalla proteina-precursore durante i processi di
trasformazione alimentare?
Da 1 g di caseina potenzialmente si originano 10 – 60 mg di PB
(Meisel, 1998)
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Principali bioattivita’ evidenziate per peptidi isolati
da proteine del latte
• Opioide (agonista ed antagonista)
• Citomodulatoria
• Anti-trombotica
• Anti-ipertensiva
• Immuno-stimolante
• Antimicrobica
• Mineral carrier
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Peptidi “opioidi”
agonisti
(es.: casomorfine e lattorfine)
antagonisti
(es.: casoxine)
Legame con recettori cellulari (μ, δ e κ)
 effetti analgesici
 stimolazione secrezione insulina e
somatostatina
 blocco della risposta
cellulare ad una sostanza
opioido-agonista
 prolungamento del tempo di transito
gastro-intestinale
comportamento
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Peptidi “opioidi”
 Caratteristiche strutturali: nella maggior parte dei casi similarità con
endorfine (sostanze regolatrici endogene), per la presenza di tyr (Y)
all’estremità N-terminale e di tyr o phe (F) in 3° o 4° posizione
 Applicazioni: alimentazione del bestiame per aumentarne l’efficienza
produttiva (grazie all’influenza positiva sull’assorbimento dei nutritivi)
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Peptidi citomodulatori
• Influenza sul metabolismo cellulare, in particolare sulla divisione
Cellula in presenza del peptide
 inibizione proliferazione
 induzione della apoptosi
 promozione della
divisione cellulare
• β-casomorfina 7 e CPP β-CN (1-25) inibizione proliferazione cellule leucemiche
(Meisel e Guenther, 1998);
• caseine + batteri lattici dello yogurt  influenza su cellule Caco-2
(Mac Donald et al., 1994);
• LF bovina (79-93) e β-CN (177-183) stimolano la sintesi del DNA (cellule di ratto)
(Hagiwara et al., 1995; Nagaune et al., 1989).
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Peptidi antitrombotici
Coagulazione sangue
I- fibrinogeno
trombina
fibrina (coagulo insolubile)
II- agglomerazione ed adesione delle piastrine alle maglie di fibrina
 Interazione tra le sequenze 400-411 (catena γ del fibrinogeno) e 572-575 ed i recettori piastrinici
stati patologici: formazione di “trombi” (= coaguli) frequente nell’arteriosclerosi  necessità di
farmaci anticoagulanti
 affinità strutturale e funzionale tra fibrinogeno (400-411) e la CASOPLATELINA
(κ-CN f 106-116) (Fiat et al., 1993)
 casoplatelina  recettore piastrinico  inibizione dell’aggregazione piastrinica
(Jollès et al., 1986; Mazoyer et al., 1992)
 altri peptidi: κ-CN ovina (112-116)
(Qian et al., 1995b)
e LF ovina (39-42)
1995a)
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(Qian et al.,
Peptidi immunostimolanti
• β-casochinina 10 (f 193-209 della β-CN) e β-casomorfina 7
a basse concentrazioni  soppressione della proliferazione linfocitaria;
ad alte concentrazioni  incremento della proliferazione linfocitaria
(Kayser e Meisel, 1996)
• αS1-CN (194-199), β-CN (63-68), β-CN (191-193)
fagocitosi + effetto protettivo contro Klebsiella pneumoniae
(Migliore-Samour et al., 1989)
• CPP
stimolano la produzione di IgG da parte delle cellule
della milza di ratto (Hata et al., 1998 e 1999)
• Lattoferricina f(17-41) (Shinoda et al., 1996)
Attivazione leucociti neutrofili (rilascio interleuchina-8)
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Peptidi con capacita’ legante gli ioni
(“mineral carrier”)
• IDROLISI αS1-, αS2- e β-CN  sequenze contenenti
fosfoserina: caseinofosfopeptidi (CPP)
• Interazione tra gruppo fosforico (carica negativa) ed i cationi
• Trattamenti termici  defosforilazione serina  minore
probabilità formazione di CPP
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Peptidi con capacita’ legante gli ioni
(“mineral carrier”)
• Grado di fosforilazione e capacità di legare ioni: relazione diretta
αS2 > αS1 > β > κ
• Nella maggior parte dei CPP cluster di fosfoserina
Ser-ser-ser-glu-glu
• Possibili applicazioni (Fitzgerald, 1998)
- stati di carenza nutrizionale (Fe2+, Zn2+ e Mg2+)
- rachitismo (aumento biodisponibilità Ca2+)
- prevenzione della demineralizzazione smalto dentale
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Peptidi con capacita’ legante gli ioni
(“mineral carrier”)
•αS1 (66-74)3P dall’intestino di suini nutriti con derivati lattierocaseari (Meisel e Frister, 1988)
• β-CN (7-18)3P e β-CN (29-41)1P dall’intestino umano
(Chabance
et al., 1998)
• idrolisi in vitro di Na-caseinato con enzimi di varia natura (McDonagh
e Fitzgerald, 1998)
• Peptidi mineral carrier non fosforilati da alcune siero-proteine (βLG, α-LA e LF) (Vegarud et al., 2000)
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Peptidi antimicrobici
• Importante componente dei sistemi innati di difesa
• inattivazione patogeni
• modulazione risposte infiammatorie
• Modalità d’azione:
generalmente alterano la permeabilità della membrana cellulare
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Peptidi antimicrobici - caratteristiche biochimiche -
• Ai fini dell’attività, importanti:
- carattere cationico (per prima interazione con strato fosfolipidico
carico negativamente);
- anfipaticità (canali transmembrana attraverso cui transitano gli ioni)
• Classificazione:
anfipatici ad α-elica
anfipatici a β-lamine
con ponti disolfuro
ricchi in prolina
anionici
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Peptidi antimicrobici derivati da proteine del latte:
• largo spettro d’azione
• vantaggi rispetto agli antibiotici
 lattoferricine (lattoferrina bovina, umana, murina, caprina)
 casocidina f(150-188) as2-CN (Zucht et al., 1995)
 isracidina f(1-23) as1-CN (Hill et al., 1974; Lahov e Regelson, 1996)
 f(184-210) -CN umana (Minervini et al., 2003)
 kappacina f(106-169) -CN (Malkoski et al., 2001)
 f(63-117) -casein
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Il ruolo dell’ACE nei sistemi della renina-angiotensina, della callicreina-chinina
e nel sistema immunitario. Adattata da Philanto-Leppälä et al., 2001
SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA
SISTEMA CALLICREINA-CHININA
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu
Bradichininogeno
Angiotensinogeno
Immunomodulante
chemiotassi
callicreina
Renina
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
SISTEMA
IMMUNITARIO
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg
Bradichinina
Angiotensina I
migrazione linfocitaria
stimolazione macrofagi
ACE (Angiotensin
I-converting enzyme)
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe + His-Leu
Angiotensina II
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe+Ser-Pro+Phe-Arg
Frammenti inattivi
vasocostrizione
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vasodilatazione
Peptidi anti-ipertensivi
Inibizione dell’ACE → abbassamento dei livelli della pressione arteriosa
• correlazione struttura-attività: affinità dell’ACE nei confronti di substrati
ed inibitori competitivi aventi a.a. idrofobici (es.: pro, ile, val) nelle 3 posizioni
contigue all’estremità carbossilica; tuttavia sono note anche sequenze
strutturalmente differenti (Meisel, 1997)
• Resistenza ad ulteriore idrolisi e basso P.M.: requisito per l’attività in vivo
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Peptidi ACE-inibitori nei formaggi
starter e tempo di maturazione (indice di ACEinibizione del Gouda a media maturazione > di quello a
lunga maturazione) (Gobbetti et al., 2002)
Peptide derivato dall’ s1-CN isolato da Parmigiano
stagionato di 6 mesi, ma non dopo 15 mesi di maturazione
(Addeo et al. 1992).
Peptidi a basso P.M. (es.: -CN f58-72) identificati in
diversi formaggi (Meisel et al. 1997), compresi alcuni formaggi
con tempo di maturazione breve (Crescenza e Italico) e
medio (Gorgonzola) (Smacchi and Gobbetti 1998; Stepaniak et al.
1995).
Rapporto aminoacidi liberi/aminoacidi nei
peptidi [mol/mol]
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A differenza dei peptidi bioattivi endogeni, molti peptidi derivati da
proteine del latte presentano proprietà multi-funzionali
Determinate regioni della struttura primaria delle caseine
contengono sequenze peptidiche sovrapposte che esercitano diversi
effetti biologici
Tali regioni, considerate “strategiche”, sono parzialmente protette da
un’ulteriore degradazione proteolitica (Fiat et al. 1993).
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Peptidi multifunzionali da proteine del latte (esempi)
Nome
Frammento
αS1immunocasochinina
Senza nome
αS1-CN f(194-199) TTMPLW
ACE-inibitoria; immunomodulante
αS2-CN f(1-32)
Mineral carrier; immunomodulante
Senza nome
β-CN f(1-25)
“
β-CN f(1-28)
“
β-casomorfina 7
β-CN f(59-79)
β-CN f(60-66)
β-casochinina 10
β-casochinina 7
Casoxina A
Casoxina B
Kappacina
β-CN f(193-202)
β-CN f(177-183)
κ-CN f(25-34)
κ-CN f(35-41)
κ-CN f(106-169)
Senza nome
α-lattorfina
β-lattorfina
Lattoferricina-B
Sequenzab
KNTMEHVS*S*S*EES*IISQ
ETYKQEQNMAINPSK
RELEELNVPGEIVES*LS*S*
S*EEIVPN
RELEELNVPGEIVES*LS*S*
S*EEIVPNINK
VYPFPGPIPNS*LPQNIPPLTQ
YPFPGPI
YQQPVLGPVR
AVPYPQR
YIPIQYVLSR
YPSYGLN
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAS*
GEPTSTPTTEAVESTVATLEDS
*PEVIESPPEINTVQVTSTAVc
(non glicosilata, mono- o bi-fosforilata)
YG
κ-CN f(38-39); αlattalbumina f(1819) ed f(50-51)
α-lattalbumina f(50- YGLF
53)
β-lattoglobulina
YLLF
f(102-105)
Lattoferrina f(17-41) FKC1RRWQWRMKKLGAPSI
TC1VRRAFd
Attività biologica
Mineral carrier; citomodulatoria;
immunomodulante
Mineral carrier; immunomodulante
Mineral carrier; immunomodulante
Opioido-agonista;
ACE-inibitoria;
immunomodulante
ACE-inibitoria; immunomodulante
Immunomodulante; ACE-inibitoria
Opioido-antagonista; ACE-inibitoria
Opioido-antagonista; ACE-inibitoria
Antimicrobica; inibizione secrez.
gastrica (se glicosilata)
Immunomodulatoria; ACE-inibitoria
Opioido-agonista; ACE-inibitoria
Opioido-agonista; ACE-inibitoria
Antimicrobica; immuno-modulante
Sebbene la liberazione di peptidi bioattivi da proteine
alimentari sia stata studiata a fondo negli ultimi decenni,
soltanto pochi studi hanno considerato le potenzialità dei
batteri lattici in tal senso.
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I batteri lattici, o enzimi da essi derivati, come mezzo per
produrre peptidi bioattivi?
I risultati sono controversi e non è possibile generalizzare, poiché
occorre considerare vari fattori:
1)
2)
3)
4)
Materia prima
Tecnologia
Tipo di prodotto
Starter impiegato (variabilità inter- ed intra-specifica del
corredo enzimatico)
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Produzione di peptidi bioattivi da idrolizzati di Na-caseinato mediante
proteinasi di Lactobacillus helveticus PR4
(Minervini et al., 2003)
•
COMPARARE le potenzialità di latte di specie diverse nel generare peptidi ad
attività antipertensiva
•
PRODURRE idrolizzati di Na-caseinato arricchiti in peptidi bioattivi multifunzionali
verificando la possibilità di utilizzare enzimi derivati da un microorganismo
largamente utilizzato nella biotecnologia lattiero-casearia (Lactobacillus helveticus)
I.
Fasi del lavoro: II.
III.
IV.
Produzione di Na-caseinato a partire da latte di 6 specie (bovino,
suino, caprino, ovino, bufalino ed umano)
Idrolisi del Na-caseinato con una proteinasi parzialmente purificata
da Lb. helveticus PR4
Analisi RP-FPLC degli idrolizzati
Identificazione dei peptidi contenuti nelle frazioni attive tramite MS e
degradazione di Edman
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Cromatogrammi RP-FPLC degli idrolizzati di Na-caseinato
SUINO
BOVINO
BUFALINO
OVINO
CAPRINO
UMANO
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Sequenze, e corrispondenti frammenti di caseina, dei peptidi identificati nelle frazioni degli
idrolizzati di Na-caseinato prodotti con la proteinasi parzialmente purificata di Lb. helveticus PR4.
Tipo di latte
o frazione
Bovine
16
17
18
Sheep
4
6
Goat
3
4
Buffalo
4
Human
4
Sequenzaa
aSingle-letter
Massa teoricab
-CN f58-76
S1-CN f24-47
S1-CN f169-193
-CN f58-76
S1-CN f24-47
-CN f58-76
2100.28
2194.35
2122.27
2100.28
2194.35
2100.28
2100.13
2194.14
2121.93
2100.13
2194.14
2100.13
RPKHPI
RPKH
HPIKH
TVDQ
HQK
S1-CN f1-6
S1-CN f1-4
S1-CN f4-8
S2-CN f182-185
S2-CN f186-188
746.90
537.32
631.37
599.42
411.46
746.46
537.35
631.38
599.35
411.22
LVYPFPGP
TVDQHQ
-CN f58-65
S2-CN f182-187
888.47
727.33
888.96
727.24
LVYPFPGPI
-CN f58-66
1002.14
1001.56
QPQ
VPQ
-CN f44-46
-CN f77-79 or
f137-139 or 155157
-CN f141-143
or f163-165 or CN f74-76
-CN f184-210
371.26
342.26
371.30
342.22
356.36
356.39
3132.8
3133.39
QELLLNPTHQYPVTQPLAPVHNPISVc
amino acid code is used.
masses are reported.
cThe only peptide which had antibacterial activity. All the other peptides were ACE inhibitors.
bMonoisotopic
Massa
osservatab
LVYPFPGPIPNSLPQNIPP
FVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSE
LGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEK
LVYPFPGPIPNSLPQNIPP
FVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSE
LVYPFPGPIPNSLPQNIPP
IPQ
19
Frammento
di CN
Attività ACE-inibitorie delle frazioni peptidiche grezze
(non purificate) e dei peptidi sintetizzati
Frazioni peptidiche o peptidi sintetizzati
IC50a (g/ml or mol/lb)
Idrolizzato di Na-caseinato bovino
frazione 16
frazione 17
57,2
16,2
frazione 18
23,9
Idrolizzato di Na-caseinato ovino
frazione 4
frazione 6
120,2
786,0
S1-CN f(1-6) dalla frazione 4
30,1 (40,3 b)
S1-CN f(1-4) dalla frazione 4
>1000 (>1863 b)
S1-CN f(4-8) dalla frazione 4
800,5 (1269,2 b)
S1-CN f(1-6) + f(1-4) dalla frazione 4
90,4
S1-CN f(1-6) + f(4-8) dalla frazione 4
70,2
S1-CN f(1-4) + f(4-8) dalla frazione 4
715,8
Idrolizzato di Na-caseinato caprino
frazione 3
frazione 4
147,3
210,5
Idrolizzato di Na-caseinato bufalino
frazione 4
112,6
-CN f(58-66) dalla frazione 4
180,6 (183,5 b)
Idrolizzato di Na-caseinato umano
frazione 4
228,1
Inibizione di Staphylococcus aureus (A),
Escherichia coli K12 (B) e Bacillus megaterium
(C) da parte della frazione 19 dell’idrolizzato di
Na-caseinato umano
Attività antibatterica del frammento -CN
f184-210 identificato nella frazione 19
dell’idrolizzato di Na-caseinato umano
Microrganismo indicatore
Inibizione
1
2
a
Lactobacillus helveticus PR4
Lactobacillus
delbrueckii
subsp.
+
delbrueckii B15
Lactobacillus plantarum 20B
-
Lactobacillus casei subsp. casei 2047
+
Lactobacillus sanfranciscensis CB1
++
Enterococcus faecium X95
+
Lactococcus lactis subsp. cremoris ST7
++
Bacillus megaterium F6
+
Escherichia coli F19
++
3
4
Escherichia coli K12
+
5
6
Listeria innocua DSM 20649

Salmonella spp.
+
Yersinia enterocolytica X8
+
Staphylococcus aureus ATCC 25923

A
B
C
QELLLNPTHQYPVTQPLAPVHNPISV
aSimboli:
++, zona di inibizione molto ampia (ca. 2.0 cm); +,
zona di inibizione ampia (ca. 1.5 cm); , zona di inibizione
media; -, nessuna zona di inibizione.
Conclusioni
i.
Serino-proteinasi di Lb. helveticus PR4 utilizzabile per la genesi di PB
ii.
Le similarità o le differenze tra i PB sono dovute al grado di omologia
ed alla conformazione nativa delle caseine da cui essi originano
iii.
Gli idrolizzati di Na-CN possono essere proposti come alimenti
funzionali con potenziale azione ipotensiva
iv.
β-CN umana come precursore di un peptide antibatterico ad ampio
spettro d’azione
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Isolamento di peptidi antimicrobici
da diverse varieta’ di formaggi italiani
(Rizzello et al., 2005)
Scopo del lavoro:
purificazione, identificazione e caratterizzazione di peptidi antimicrobici isolati
da diverse varietà di formaggi italiani, differenti per tempo di maturazione, tipo
di latte, caglio e starter microbici utilizzati.
Fasi del lavoro:
I.
II.
III.
IV.
V.
Analisi RP-FPLC degli estratti acquosi dei formaggi
Saggio delle frazioni per l’inibizione di un microrganismo indicatore
Purificazione (RP-FPLC) delle frazioni attive
Saggio e caratterizzazione dello spettro d’azione delle frazioni attive
Identificazione dei peptidi (MS) contenuti nelle frazioni dotate di attività antimicrobica
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Analisi RP-FPLC e separazione in frazioni degli estratti acquosi
mAU
3000
mAU
Mozzarella di bufala
mAU
Canestrato
3000
3000
2500
2500
2500
2000
2000
2000
1500
1500
1500
1000
1000
1000
500
500
500
0 0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
0 0.0
min
mAU
mAU
Caciocavallo
3000
3000
20.0
40.0
60.0
80.0
min
0 0.0
mAU
Caprino del Piemonte
3000
2500
2500
2500
2000
2000
2000
1500
1500
1500
1000
1000
1000
500
500
500
0 0.0
20.0
mAU
40.0
60.0
80.0
0 0.0
mAU
Crescenza
3000
min
3000
20.0
40.0
60.0
80.0
min 0 0.0
2500
2000
2000
2000
1500
1500
1500
1000
1000
1000
500
500
500
40.0
60.0
80.0
min 0 0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
min 0 0.0
40.0
60.0
80.0
min
Pecorino Romano
20.0
40.0
60.0
80.0
min
Gorgonzola
3000
2500
20.0
20.0
mAU
Parmigiano Reggiano
2500
0 0.0
Formaggio di Fossa
20.0
40.0
60.0
80.0
m
Attività inibitoria delle frazioni ottenute mediante RP-FPLC
dagli estratti acquosi dei formaggi.
Fraz.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Crescenza
+
+
+
+
+
±
Mozzarella di
bufala
Pecorino
Romano
++
++
++
±
Caprino del
Piemonte
Caciocavallo
Parmigiano
Reggiano
Gorgonzola
+
±
+
±
±
+
±
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Canestrato
Pugliese
±
±
±
+
±
±
+
Formaggio di
Fossa
Spettro d’azione delle frazioni 2, 3 e 4 ottenute per frazionamento
RP-FPLC da estratto acquoso di Mozzarella di bufala
Frazione
Lb. sakei
E. coli k12
B. megaterium
S. aureus ATCC
25923
L. innocua DSM
20649
Lb. helveticus
PR4
Lc. lactis subsp.
cremoris WG2
2
+
+
+
+
+
+
+
3
+
+
+
+
+
+
+
4
+
+
+
+
+
+
+
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Sequenze peptidiche identificate nelle frazioni dell’estratto acquoso
prodotto da formaggio Crescenza
Frazione
Frammento
Sequenza
18
f20-23 (αs1-CN)
LLRF
22
f24-33 (αs1-CN)
FVAPFPEVFG
f189-199 (β-CN)
GPVRGPFPIIV
f186-199 (β-CN)
PVLGPVRGPFPIIV
f183-199 (β-CN)
YQEPVLGPVRGPFPIIV
f126-134 (κ-CN)
MAIPPKKNQ
f126-135 (κ-CN)
MAIPPKKNQD
f24-32 (αs1-CN)
FVAPFPEVF
24
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Isracidina f(1-23) as1-CN
RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF
Kappacina f(106-169) -CN
MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVES
TVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV
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Conclusioni
• Latti di diverse specie costituiscono potenziali matrici per la produzione di
alimenti funzionali contenenti peptidi antipertensivi
• Presenza e distribuzione dei peptidi antimicrobici nei diversi formaggi
• Analogie strutturali con peptidi bioattivi riportati in letteratura
• Probabile ruolo nel mantenimento di determinate condizioni igienicosanitarie nel prodotto finito
• Compatibilità tra dosi di prodotti lattiero-caseari comunemente assunte e
apporti significativi di peptidi antimicrobici
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Peptidi bioattivi in alimenti funzionali
Allo stato attuale, i CPP ed i peptidi ipotensivi sono tra gli altri, quelli
che sono stati maggiormente proposti come ingredienti di alimenti ideati
per fornire benefici specifici
L’odierna conoscenza dei peptidi bioattivi incoraggia la messa a
punto di alimenti funzionali contenenti PB prodotti con l’impiego di
microrganismi “GRAS” (Generally recognized as safe)
L’isolamento di peptidi bioattivi da idrolizzati proteici è una strategia
caratterizzata da rese basse e costi elevati
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Prodotti lattiero-caseari con proprietà funzionali: formaggio “Festivo”
(Ryhanen et al., 2001)
- prodotto su scala industriale
- basso contenuto in grassi (11%)
- stagionato 13 settimane;
e contenente:
- peptidi bioattivi (attività antipertensiva)
- CLA (0,45%) attività anticarcinogenica e antiarteriosclerosi
- microrganismi probiotici (Lb. acidophilus e Bifidobacteria)
aggiunti allo starter commerciale dopo la pastorizzazione del latte
- calcio
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Uso di DNA ricombinante per la sintesi di peptidi ACE-inibitori
Coppia di oligonucleotidi (nor e rev)
codificanti per BP1, BP2 e BP3
BP1 (β-CN f.57-66) :
FAQTQ SLVYPFPGPI PNSLP
BP2 (β-CN f.73-82):
NSLPQ NIPPLTQTPV VVPPF
BP3 (β-CN f.47-52):
EDELQ DKIHPF AQTQS
Amplificazione primer e clonaggio nel
vettore di trascrizione pGEM-T
Trasformazione delle cellule di Escherichia
coli tramite vettore pGEX
Liberazione della proteina di fusione dalle
cellule ricombinanti pGEX
Purificazione della proteina di fusione
(cromatografia di affinità)
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Uso di DNA ricombinante per la sintesi di peptidi ACE-inibitori
Rilascio di BP1, BP2 e BP3 per azione di
una proteinasi di Lactobacillus helveticus
BP1
BP2
BP3
NH2
COOH
BP1
BP2
BP3
Raccolta di frazioni cromatografiche contenenti BP1, BP2, BP3
Applicazione: BP1, BP2 e BP3 in un latte fermentato
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Preparazione di bevande lattiche addizionate di peptidi bioattivi
•
B) Aggiunta dei singoli peptidi a skim milk, inoculo con Lb. acidophilus e fermentazione (FM = latte
fermentato)
Saggio di ACE-inibizione sulla frazione pH 4.6 solubile di ciascun campione
% di ACE inibizione
•
A) Aggiunta dei singoli peptidi a skim milk (UM = latte non fermentato)
100
90
80
70
60
UM
50
40
30
20
10
0
FM
controllo
+ BP1
+ BP2
+ BP3
Latti fermentati contenenti peptidi ACE-inibitori
CALPIS sour milk
 Latte scremato fermentato (37°C, 22 h) con Lactobacillus helveticus e
Saccharomyces cerevisiae
 Diffuso in Giappone da diversi decenni
 1995: ricerche sul contenuto in peptidi del Calpis
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CALPIS sour milk
 IPP e VPP da caseina (Lb. helveticus) (Nakamura et al., 1995)
 attività ACE-inibitoria in vitro (IC50< 10 M)
 attività anti-ipertensiva su ratti
 100 ml Calpis (0,025 – 0,033 mg peptide/kg di peso corporeo) per 8
settimane su pazienti ipertesi (con controllo placebo);
 ETICHETTA “FOSHU”
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EVOLUS fermented milk
fermentazione con Lb. helveticus LBK 16 H (37°C, 20 h)
 ACE-inibizione: IPP (1,5 mg/100 g) e VPP (2 mg/100 g)
 composizione elettrolitica (poco Na+, apporto di Ca2+, K+ e Mg2+)
 ETICHETTA “FOSHU”
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EVOLUS fermented milk
- prove cliniche -
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Sviluppi futuri
Sviluppo di modelli dinamici in vitro con la finalità di studiare l’effetto interattivo di
componenti bioattive multifunzionali (Schanbacher et al. 1998).
Messa a punto di un metodo di frazionamento su scala industriale degli idrolizzati
proteici.
Studio dell’influenza di diverse tecnologie (in particolar modo, nuove tecnologie, come
I trattamenti con alte pressioni) sulla genesi di PB
Studio di peptidi che inibiscono enzimi prolino-specifici. Le prolil endopeptidasi (PEP)
possono essere coinvolte nei processi di apprendimento e di memorizzazione ed è stato
dimostrato che esse possono generare il peptide “amyloid A4”, alla base del morbo di
Alzheimer (Steinmetzer et al. 1993; Saito et al. 1997).
Sviluppo di una grande varietà di alimenti funzionali fermentati
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