L’INDACO
L’indaco è una sostanza blu usata
come colorante tessile fin dall’antichità
in quanto è estraibile dal fusto di
alcune piante tropicali del genere
Indigofera ed in minor misura della
pianta europea Isatis tinctoria. La
struttura molecolare dell’indaco fu
determinata nel 1878 e la sua prima
sintesi fu realizzata nel 1882.
L'indaco, nelle regioni del Sahel della Mauritania, è
uno dei simboli di prestigio più ricercati.
La tunica dei Tuareg, ad esempio, è tutta indaco,
colore considerato nobile. I mauritani, nelle zone del
corpo non coperte da indumenti, si spalmano una
polvere color indaco che li protegge dai raggi solari
e dà origine al soprannome di "uomini blu" conferito
alle popolazioni nomadi dell'area.
L’INDACO
Si può ricavare dalla fermentazione delle foglie di
Indigofera tinctoria. Il liquido giallo-verde che si
ottiene dalla fermentazione viene fatto ossidare
all'aria in ampie vasche, nelle quali viene
costantemente agitato. Man mano che progredisce
l'ossidazione, il colore della soluzione vira
gradualmente fino a diventare un viola-bluastro
caratteristico, il color indaco.
Il deposito melmoso che si è formato viene quindi
raccolto e riscaldato per bloccarne la
fermentazione. Una volta asciugato, viene messo in
commercio in forma di pani.
Adolf Von Baeyer, premio Nobel nel 1913
O
N
H
H
N
O
già nel 1897 incominciò la produzione su scala
industriale dell’indaco di sintesi
Spettro UV/visibile
a. Spettro prodotto naturale
b. Spettro prodotto di sintesi
c. Spettro prodotto su tela
Viene anche prodotto per sintesi chimica. Fu Adolf Von Baeyer, premio Nobel nel
1913, a mettere a punto per primo il processo di sintesi.
Per soddisfare le esigenze del settore tessile, già nel 1897 incominciò la
produzione su scala industriale dell’indaco di sintesi, che soppiantò nel giro di
qualche decennio l’uso dell’indaco di origine naturale. Oggigiorno l’indaco è
sempre largamente usato essendo il colorante tipico dei blu-jeans ed è tutto di
origine sintetica (se ne producono, a livello mondiale, circa 17000 tonnellate
all’anno).
SINTESI CHIMICA DELL’INDACO
2-nitrobenzaldeide
Stechiometria della reazione
H
O
C O
+
2
H3C C CH3
2
+
2 NaOH
NO2
O
H
N
O
+
N
H
O
Indaco
2 H3C C
ONa
+
4 H2O
Procedura sperimentale
In una beuta da 250 ml a collo largo si mettono nell’ordine 1 g di 2-nitro-benzaldeide, 20 ml di
acetone e 30 ml di acqua. Mantenendo la miscela in agitazione (mediante una piastra agitante
oppure semplicemente agitando il recipiente con la mano) si gocciolano lentamente con una
“pipetta di Pasteur” 5 ml di una soluzione acquosa 2 Molare di idrossido di sodio. Poichè la
reazione provocata dall’idrossido di sodio è esotermica, la miscela di reazione si scalda:
occorre regolare la velocità di gocciolamento in modo che la miscela rimanga tiepida e non
superi i 45 °C (cioè non scotti). Terminata l’aggiunta, si lascia sotto agitazione per 30 minuti in
modo che la reazione si completi. A questo punto, si raccoglie il solido formatosi mediante
filtrazione su Buchner con aspirazione; se rimane un po’ di solido nella beuta di reazione, si usa
acqua per effettuarne il trasferimento sul filtro. Il solido raccolto sul Buchner viene spremuto
con la spatola, lavato con 10 ml di acqua, spremuto di nuovo e quindi lavato con 10 ml di
etanolo. Si trasferisce il prodotto in un pallone da 50 ml con collo a smeriglio e, tramite una
bolla paraspruzzi, lo si lascia sotto vuoto per 15 minuti per essiccarlo.
Meccanismo della reazione
La formazione dell’indaco, la cui prima sintesi è stata certamente un risultato non previsto ed
in parte frutto della casualità, non è di immediata comprensione poiché essa comporta una
serie di trasformazioni che avvengono in spontanea e rapida successione e che sono state
chiarite con uno studio decennale.
1°) Reazione di addizione al doppio legame carbonio-ossigeno del gruppo funzionale
“aldeidico”, resa possibile dalla presenza di una base che facilita la rottura eterolitica del
legame carbonio-idrogeno dell’acetone (ovvero la deprotonazione dell’acetone):
H
H
C O
+
H O
+
H2C C CH3
NaOH
OH O
C CH2 C CH3
+
N O
N O
O
O
2°) Reazione di condensazione (= eliminazione di una molecola di acqua) tra due gruppi
funzionali della stessa molecola con formazione di un ciclo:
H
OH O
C CH2 C CH3
H
H2O
+
+
OH
O
C CH3
+
N
N O
O
O
3°) Ossido-riduzione tra due gruppi funzionali della stessa molecola, in quanto uno è ossidabile
(il gruppo funzionale “alcol secondario”) e l’altro ha proprietà ossidanti (il gruppo funzionale “Nossido”):
H
O
OH
O
O
C CH3
C CH3
+
N
+
H2O
N
O
4°) Reazione di frammentazione della molecola per rottura del legame tra i due atomi di carbonio
adiacenti ad atomi molto elettronegativi (ossigeno, azoto) i quali polarizzano gli elettroni di
legame favorendo l’attacco nucleofilo da parte dell’anione idrossido:
O
O
O
C CH3
N
O
+
H
NaOH
N
+
H3C C
ONa
5°) Dimerizzazione a seguito dello spostamento dell’atomo di idrogeno dal carbonio all’azoto:
O
O
H
N
H
2
N
N
H
O
SINTESI BIOCATALITICA DELL’INDACO
Stechiometria della reazione
O
2
N
H
H
N
+ 3 O2 + 2 NADH + 2 H+
+2
N
H
NAD+ + 4 H2O
O
indolo
Meccanismo della reazione
La formazione biocatalizzata dell’indaco comporta una serie di
trasformazioni che avvengono in successione e che sono in
parte catalizzate dall’enzima e in parte spontanee.
NB indolo è un sottoprodotto della digestione del triptofano
O
H
+
O 2H
E. coli JM109
(pVL 1343A+pMS13)
N
H
OH
O
O
H
OH
H
N
H
2e-
N
H
H
1°) Reazione di addizione al doppio legame carbonio-carbonio dell’anello
eterociclico dell’indolo, resa possibile dalla presenza di un enzima ossidativo
che utilizza l’ossigeno atmosferico e due equivalenti di potere riducente. Il sito
catalitico contiene uno ione Fe2+ in grado di attivare la molecola di ossigeno.
Successivamente, intervengono due elettroni, attraverso una catena
ossidoriduttiva di trasporto che li ottiene dal NADH. Quest’ultimo deve poi
essere rigenerato; nelle cellule ciò avviene nella respirazione.
2°) Reazione di eliminazione di una molecola di acqua con ripristino dell’aromaticità.
OH
H
OH
OH
N
H
+ H2O
H
N
H
3°) Ossidazione spontanea all’aria con dimerizzazione. Si forma dapprima l’indossile (stesso
intermedio della sintesi chimica.
OH
O
+ 2 H2O
+ O2 + 2 H+
2
N
H
N
O
O
H
N
2
N
N
H
O
Reazione di sintesi dell’indaco(Chimica)
Risospendere in una beuta da 100 mL la cellule precedentemente preparate in 20
ml di tampone fosfato (o terreno minerale) a pH 7 e misurare la densità ottica,
utilizzando un spettrofotometro UV/visibile alla lunghezza d’onda di 600 nm.
La misura viene effettuata prelevando con una pipetta calibrata 100 μL di
sospensione cellulare, diluendo a 1 mL con terreno minerale ed effettuando la
lettura dell’assorbanza.
Aggiungere 10 μL di una soluzione al 40% (pari a 4 mg) di glucosio (0.2% w/v) e 10
mg di indolo (0.5g/L, i.e. 4.3 mM), pesati utilizzando una bilancia analitica
(precisione = 0.0001 g).
Inserire un’ancoretta magnetica e mettere in agitazione su piastra a 30 °C per 30
minuti. Si sviluppa una colorazione blu.
Estrarre la sospensione aggiungendo 20 ml di AcOEt, prelevati con un cilindro
graduato, direttamente nella beuta di reazione, e agitando bene per 10 minuti.
Fermare l’agitazione e lasciare separare le fasi.
Prelevare con una pipetta calibrata 200 μL di AcOEt e diluirli a 1 mL, trasferire in
una cella da UV e misurare l’assorbanza a 600 nm (ripetere l’operazione 3 volte).
Utilizzando una retta di taratura (o il coefficiente di estinzione molare per l’indaco),
calcolare la quantità di indaco formatosi, la resa della reazione e l’attività del
biocatalizzatore, espressa come mmoli/min/DCW. DCW = Dry Cell Weight, in
grammi; si può ottenere approssimativamente dall’OD, secondo un rapporto che
dipende dal microrganismo (nel caso di E.coli il rapporto è 1 unità OD = 0.5 g
DCW).
Tempo totale dell’esperienza chimica 90 minuti
Reazione di sintesi dell’indaco(Chimica)
Determinazione della velocità di reazione (se possibile)
Effettuare 4 prelievi da 1 mL ogni 15 minuti (tempi: 15, 30, 45, 60) utilizzando la
pipetta calibrata, metterli in una provetta ed estrarre la sospensione aggiungendo 3
ml di AcOEt, prelevati con la pipetta graduata, tappare la provetta e agitare bene
per 1-2 minuti.
Fermare l’agitazione e lasciare separare le fasi.
Prelevare con una pipetta calibrata 2 mL di AcOEt (Etil acetato: Ac Acetato - O- Et
etilico C2H3O-O-C2H5) e trasferirli in una cella da UV e misurare l’assorbanza a
600 nm.
Utilizzando una retta di taratura (o il coefficiente di estinzione molare per l’indaco),
calcolare la quantità di indaco formatosi e riportare su un grafico la concentrazione
in funzione del temp, calcolare la velocità di reazione, espressa come
mmoli/min/DCW.