CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO
RESPIRATORIO
Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
Journal Club
MicroRNA and Lung Cancer
Università di Modena e Reggio Emilia
CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO
RESPIRATORIO
Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
New Engl J Med 2005; June 9; 23:2446-2448
MicroRNA and Lung Cancer
Matthias Eder, Michaela Scherr
Università di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare
Università di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare
Università di Modena e Reggio Emilia
LA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA
1)
Mutazioni puntiformi
2)
Amplificazione genica
3)
Traslocazioni cromosomiche
4)
delezioni
On
ONCOGENE: carattere dominante
ONCOSOPPRESSORE: carattere recessivo
Oncosoppressori
Oncogeni
On
Oncogeni
Off
Off
Oncosoppressori
Chronology of genetic and molecular lesions
Normal
Hyperplasia
Metaplasia
Dysplasia
ISC
Carcinoma
3p9p17pAneuploidy
P53 mut
Ras mut
Telomerase + FHIT
Rb
C.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44s
MAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCER
Clinics in chest medicine, march 2002 vol.23; n1:83
SCLC (%)
NSCLC (%)
Proto-oncogenes and growth stimulation
Putative autocrine loops
GRP/GRP receptor
SCF/KIT
RAS mutation
MYC amplification
HGF/MET
NDF/ERBB
<1
15-20
15-30
5-10
75-95
10-35
100
80-85
Other molecular changes
BCL-2 expression
Telomerase activity
RAS
Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo
legano GTP e allo stato inattivo legano GDP
Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21
quiescenza della proteina
ras
) nel ritorno allo stato di
Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone
12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del
polmone
La mutazione è correlata all’abitudine tabagica
Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000
MUTAZIONE DI KRAS
Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83
Drugs that inhibit mutant
KRAS expression or
function
Drugs that block specific
downstream signals
Mutant
KRAS
active
Inactive
KRAS
active
KRAS
GAP
Inactive
KRAS
GTP
GDP
GTP
GAP
GDP
+
+
Downstream signal transduction cascade
Ras e stimoli proliferativi
Cellular Signalling 2000; 12: 425-434
PDGFR
EGFR
a
Integrine
GPCR
IL-2R
b
Ras
AF-6
Gap Junctions
RGL
PI3K
Raf
PLD
Akt
MAPK
Rin1
Effetti biologici
BCR
Mekk
Nore1
JNK
?
RAS
Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi
polmonari
Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia
polmonare NSCLC
la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento
con gefitinib
Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234
MicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare
Università di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA
• Piccoli frammenti di RNA (lunghezza 21-25
nucleotidi) non codificanti
• Regolazione negativa della trascrizione
genica mediante ibridazione a sequenze
complementari nella regione 3’ (3’UTR) del
mRNA target
• Meccanismo simile nelle piante e negli
animali
• Alcuni miRNA sono alterati nelle neoplasie
Università di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA: sintesi
Nature 2005;435:745-746
RISC: RNA-induced silencing complex
Interazione tra microRNA e mRNA target
Journal of Cell Biology 2002; 156:17-21
Università di Modena e Reggio Emilia
Funzione dei microRNA
3’ UTR
mRNA
3’ UTR
RISC
mRNA
microRNA
RISC
microRNA
Clivaggio dell’mRNA
Cell 2004; 116:281-297
Inibizione della
trascrizione proteica
Fig. 1. Correlation between FRAs and miRs
Sito fragile:regione
cromosomica soggetta a
rottura spontanea o indotta
Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
Fig. 3. MiRs as cancer players
Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
MicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare
Università di Modena e Reggio Emilia
Let-7
• lethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNA
• La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo cellulare
comportando divisione delle cellule in modelli sperimentali
• Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per let-7 che
mappano regioni delete nelle neoplasie
• la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee
cellulari di tumore polmonare
Università di Modena e Reggio Emilia
microRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in
human lung cancer in association with shortened postoperative
survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756
• Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell
2005;120:635-647
Università di Modena e Reggio Emilia
microRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in
human lung cancer in association with shortened postoperative
survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756
• Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell
2005;120:635-647
Università di Modena e Reggio Emilia
Analisi della espressione di let-7 nel tumore polmonare
Northen blot in linee cellulari
di neoplasie polmonari
HNLEC = human normal lung
epithelial cell lines
20 linee cellulari di neoplasia
polmonare
5S rRNA = controllo
Northen blot in neoplasie
polmonari in vivo
Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756
Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7
143 NSCLC
105 adk
cDNA
primer
Real-Time Reverse
Transcription-PCR
Hierarchical Clustering
cDNA
primer
Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756
microRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 microRNA in
human lung cancer in association with shortened postoperative
survival. Cancer Res 2004; 64:3573-3756
• Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell
2005;120:635-647
Università di Modena e Reggio Emilia
LA PRESENZA DI let-7 INFLUENZA LA ESPRESSIONE DI RAS
Controllo negativo
Cellule HepG2 trasfettate con
let-7
Quantificazione della
immunofluorescenza di RAS
Controllo negativo
Cellule HeLa let-7 + transfettate con
oligonucleotidi antisenso inibenti
Quantificazione della
immunofluorescenza di RAS
let-7 E’ SCARSAMENTE ESPRESSO NEL TUMORE POLMONARE
20 neoplasie:polmone,
colon,mammella
NAT: normal
adjacent tissue
Northen blot
3 Ca squamocellulari
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MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans
Eder, M. et al. N Engl J Med 2005;352:2446-2448
MicroRNA and Lung Cancer:
Conclusioni
• MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della
espressione proteica
• let-7 è in grado di inibire la trascrizione di RAS
• Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di let-7
• L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e ad un
peggioramento della prognosi nel tumore polmonare
• Possibilità di terapia genica in futuro?
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MicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonare
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Journal Club
MicroRNA and Lung Cancer
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MicroRNA AND Lung Cancer
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RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA
ATTIVAZIONE DI RAS
RAS
CAAX
RAS
CAAX
Proteolysis
Isoprenyl group
RAS
PTI
P-P Prenyltransferase +
isoprenyl-pyrophosphate
Competitive inhibitor of
prenyltransferase
K
RAS
Lys lys
COCH3
N
RAS
COCH3
H
RAS
COCH3
Cell
Membrane
CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003
c
(Rce-1)
AAX