DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE:
METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA
SU SEPHADEX G-25
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His 58, His 87
metemoglobina
La emoglobina tende ad ossidarsi, ma in
circolo solo lo 0.5% di essa si trova sotto
forma ossidata perché c’è un sistema
enzimatico (metemoglobina riduttasi) che
provede a trasformare la emoglobina
ossidata (Fe 3+) in emoglobina ridotta (Fe
2+)
metemoglobinemie
 mancanza congenita di metemoglobina riduttasi
 varianti emoglobiniche
nature new biology 237, 259-263 (28 June 1972)
Subunit Interaction of Haemoglobin M Milwaukee
M. F. PERUTZ1 , P. D. PULSINELLI2 & HELEN M. RANNE
IN four of the five different abnormal
haemoglobins that cause
methaemoglobinaemia, methaemoglobin
reductase is ineffective, because either the
proximal or the distal haem-linked histidines
in one pair of subunits have been replaced
by tyrosines.
varianti catena 
HbM Boston
HbM Iwate
HbM Saskatoon
HbM Hyde Park
HbM Milwaukee
His che interagiscono con l’eme
mutazioni che provocano
metemoglobinemie
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DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE:
METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA SU SEPHADEX G-25
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Materiali e soluzioni
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4.
Colonna cromatografica 1.5 cm (diametro interno)x 8 cm,
preimpaccata con sephadex G-25(Pharmacia PD-10)
Pipette: 200 ml, 1000ml e pipetta pasteur
Eluente: tampone fosfato 20 mM, pH 7
Sangue intero con anticoagulante, ditionito di sodio (30mg/ml), ferricianuro di potassio
(K3Fe(CN)6), metemoglobina preparata come riportato di seguito.
Procedura sperimentale
Fissare la colonna sull’apposito supporto. Preparare la soluzione di ditionito di sodio (30 mg in 1 ml di H2O distillata)
e di metaemoglobina (diluire 0.5 ml di sangue intero a 2 ml con tampone fosfato; agitare fino a completa emolisi e poi
aggiungere 15 mg di ferricianuro di potassio). Effettuare 3-4 lavaggi della colonna con tampone fosfato allo scopo di
allontanare ogni traccia della azide sodica impiegata per preservare la colonna dall’azione batterica. A colonna chiusa
applicare sul letto sephadex 100 ml di soluzione di ditionito , quindi eluire immediatamente raccogliendo 30 gocce di
tampone fosfato. Chiudere la colonna ed applicare 200 ml di soluzione di metaemoglobina. Eluire.
Risultati
Questo esperimento dimostra non solo il principio della gel cromatografia (cromatografia ad esclusione) ma anche
come poter rimuovere uno dei due prodotti di una reazione realizzata su colonna.
Il ditionito di sodio (Na2S2O4), un sale a basso peso molecolare, viene applicato come un disco molto stretto sulla
sommita’ della colonna. La metaemoglobina, essendo una sostanza ad alto peso molecolare, viene esclusa dalle
particelle porose di sephadex G-25 e pertanto si muove attraverso gli spazi interstiziali. In pratica la metaemogloina
migra piu’ velocemente del ditionito di sodio e del ferricianuro di potassio (che è presente in eccesso). Nel corso del
movimento dei diversi soluti attraverso la colonna è possibile osservare i seguenti cambiamenti:
le metaemoglobina (banda marrone) si separa dall’eccesso di ferricianuro di potassio (banda gialla) e si trasforma in
emoglobina banda di color porpora) non appena è ridotta dal ditionito. A sua volta, l’emoglobina lascia la zona del
ditionito sotto forma di banda porpora ed è quindi rapidamente trasformata in ossiemoglobina, di color scarlatto, ad
opera dell’ossigeno disciolto nell’eluente (tampone fosfato). Queste reazioni possono essere così schematizzate:
•
emoglobina + K3Fe(CN)6= metaemoglobina
•
metemoglobina + Na2S2O4 = emoglobina
•
emoglobina +O2 = ossiemoglobina
CROMATOGRAFIA
Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa
velocità attraverso la fase stazionaria
La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente
FASE STAZIONARIA
Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna
o stratificate su un supporto solido (strato sottile)
FASE MOBILE
Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria
SOSTANZE
Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile
CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO:
CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE:
le sostanze interagiscono con la superficie delle
particelle costituenti la fase stazionaria
le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione
tra fase stazionaria e fase mobile
GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata
da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente
GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente
Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH)
Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa
Sephadex
E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito
da residui di glucosio
Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroides
che crescono in un medium contenente saccarosio
Successivamente il destrano viene polimerizzato
con EPICLOROIDRINA
Tre stadi nel corso
della separazione
low molecular weight
high molecular weight
Gel particles
Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani
della fase stazionaria (equilibrio dinamico)
le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire
con esso
il sistema può essere complicato a causa di particolari
interazioni con la matrice del gel
ESERCITAZIONE
Na2S2O4
K 3Fe(CN)6
Sangue
+3
6Fe3++S2O42-
metaemoglobina
emoglobina
Fe(III)
marrone
Fe(II)
rosso porpora
4H2O
emoglobina ossigenata
rosso
+6
2SO42- + 8H+ + 6Fe2+
1) Aggiungo prima ditionito di sodio
2) Poi metaemoglobina
metaemoglobina
ditionito
marrone
rosso porpora
rosso
La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando
allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossa
e successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di
Ossigeno nelle soluzioni in colonna