CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
AA 2008-09
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE n° 5
siRNA
Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI
FARMACI
TRADIZIONALI
DNA duplicato
DNA
RNA
PROTEINA
Duplicazione
Trascrizione
Maturazione
Metabolismo
Traduzione
ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI
1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA
2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA
3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA
4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una
sequenza aminoacidica (competono con l’RNA nella
interazione tra RNA e proteina)
5. DECOY:
DNA complementare a sequenze aminoacidiche
(competono con sequenze di DNA nell’interazione DNAproteina)
6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche
RNA Interference: il processo attraverso il quale un
RNA a doppio filamento interferisce con
l’espressione genica:
sia inducendo la degradazione di RNA complementare
che bloccandone la traduzione
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
In 1998 Fire and Mello
described the presence
of si RNA in C.elegans
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
Stanford University University
of Massachusetts
b. 1960
b. 1959
Nel 2001 Tuschl et al.
dimostrano che una
piccola sequnza di RNA
puo’ interferire in modo
specifico con la
trascrizione
Interferenza basata su RNA (RNA interference)
Attori:
Micro RNA (miRNA) precursori a forcina
Ribonucleasi DICER
Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)
RISC RNA RNA driven interference silencing complex che
comrende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento
e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso 8° 10-11 nt
risptto al terminale 5’.
Il complesso RISC attivato riconosce
sequenze complementari di RNA, le lega e
degrada: questo puo’ avvenire diverse volte
in quanto l’RNA antisenso, protetto dal
complesso proteico è stabile e in cellule che
si dividono lentamente puo’ agire per 3-7
giorni.
Risc unwinds dsRNA,
the ribonuclease in the
Ribonuclese complex hydrolizes
new targets
LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA
Nature Reviews Genetics 2007, 8:884
RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)
RNA interference-mediated heterochromatin assembly
siRNAs are thought to guide
histone methyltransferases
(HMTs) to the chromatin to
modify histone H3 on lysine 9
(H3K9). The methylated form
of H3 is bound by Swi6 or HP1,
which also associates with the
methyltransferases, to
maintain the silenced state. m,
methyl group.
Marjori A. Matzke & James A. Birchler
Nature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005
Attività di siRNA a livello del nucleo
Metilazione di citosine in frammenti di DNA
complementari (descritta in vegetali)
Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito,
cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la
metilazione di istoni e la formazioe di eterocromatina)
Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)
RNA lungo a doppio filamento
shRNA plasmidico
siRNA sintetico
a doppio filamento
miRNA endogeno
20-25 NT
Formazione del complesso RISC (RNA
induced silencing complex)
Amplificazione
RNA-dip RNA polimerasi
funzione
miRNA
Blocco traduzione
Complesso RISC attivato
funzione
siRNA
Formazione doppia elica con RNA complementare
e attacco di endonucleasi
si RNA – caratteristiche
RNA a doppia elica di 21-23 nt
Presenza di terminale 3’ più lungo di 2nt
Presenza di gruppi OH in 3’
Presenza 5’ fosfato
Alta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)
Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)
Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi
2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche
Non deve essere complementare a zone introniche
Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.
si RNA – caratteristiche
CELLULE HELA
In rosso: siRNA marcato
In blu: nuclei
In verde la proteina GAPDH
si RNA non specifico
Trattamento: 48h
si RNA contro GAPDH
siRNA come agenti terapeutici
LA DISTRIBUZIONE
Problematiche tipiche delle molecole di grandi
dimensioni e che sono altamente polari
Degradabilità dovuta a Rnasi circolanti (RNA
naturale puo’ essere utlizzato in cervello e polmoni)
Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori
localizzati)
siRNA come agenti
terapeutici
LA
SOMMINISTRAZIONE
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol,
iniezione intratumorale
2. Somministrazione sistemica:
a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le
membrane, fino a 200 nm passano solo capillari
fenestrati : uso di nanocarrier)
b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la
farmacocinetica
c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA a
della cellula bersaglio
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
Modificazione delle molecole di siRNA per una
distribuzione più efficiente
modificazioni per evitare le difese
immunitarie (modificazione con 2’-ometile nel filamento antisenso)
fosforotionati per bloccare esonucleasi
coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG
BIODISTRIBUZIONE
Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*,
Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†,
Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay*
Nature, 2002
siRNA IN STUDI CLINICI
Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso
Similarità:
- lunghezza
- metodologia di delivery comune
- induzione di silenziamento genico a livello
post-trascrizionale
- digestione di RNAm bersaglio da parte di
endonucleasi
- possibilità di stabilizzzione con basi
modificate
- similarità nella biodistribuzione
Differenze:
- doppio filamento verso singolo filamento
- maggiore stabilità della molecola naturale
- maggiore efficacia in cellule in coltura
- meccanismo di azione mediato da RISC
Riferimenti bibliografici
Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA
pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884
Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature
Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556
Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by
systemic adminitrtion.
Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142
Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down
barriers: advances in siRNA delivery Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138
(February 2009)
Scarica

lezione 5