Aspetti generali
della
Trasduzione del Segnale
Concetti chiave
Specificità
Amplificazione
Integrazione
Interruttori ‘On-Off’
Feedback
Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI
problemi di comunicazione
Hei tu – I tuoi
outputs sono
troppo deboli!!!
Oi! Abbiamo
bisogno di
inputs!
?
Per piacere,
vuoi smettere di
inviare segnali?
Avanti N. 7,
adesso devi
spegnerti!
I Problemi del Signalling
Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di
segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi,
piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce,
calore o variazioni dell’osmolarità)
Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti
Captare segnali di bassa intensità
Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare
Le soluzioni
Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti
Recettori con un alto grado di specificità
Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni)
Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione
Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’
intracellulare
Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un
limitato numero di processi comuni
Cosa fanno I segnali
Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi
Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione del
metabolismo del glicogeno in risposta all’insulina
Eccitamento p.es. propagazione dell’impulso nervoso in
risposta a neurotrasmettitori
Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a fattori di crescita
Morte cellulare programmata causata da specifici fattori di
‘morte’ o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali
Espressione genica alterata – p.es. Sintesi di nuove
proteine di membrana in risposta ad un incremento dell’attività
sinaptica (plasticità sinaptica)
Far attraversare il segnale
Molti segnalatori (p.es.
neurotrasmettitori) non possono
attraversare la membrana
ploasmatica. Le cellule risolvono
questo problema utilizzando recettori
transmembrana. Questi sono proteine
posizionate in membrana con il sito
attivo per il ligando* sul lato
extracellulare e un dominio
intracellulare che si accoppia al passo
successivo nella catena di trasduzione
del segnale
*Ligando – una molecola che si lega ed è
riconosciuta da un recettore
Dominio di
legame
extracellulare
Membrana plasmatica
esterno
iinterno
Dominio
transmembrana
Dominio intracellulare –
si accoppia al passo
successivo (può avere
attività enzimatica)
Definizione di Recettore
Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una
semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri
Specificità – un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali
spesso strettamente correlati
Alta affinità – Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse
concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM
Saturabilità – una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite
al numero di molecole di ligando che una cellula può legare
Reversibilità – l’associazione ligando-recettore non è covalente – quando la
concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi
Accoppiamento – il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula
É quest’ultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una
proteina di legame
Curva di attivazione - Saturazione
k3
k1
k2
(A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione
della curva
(B) Se varia l’affinità del recettore per il messaggero la curva trasla sull’asse
delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione.
Risposte iperboliche e sigmoidi
Una risposta iperbolica
sigmoide denota
insorgecooperatività
ogni qual volta
e insorge
un recettore
ogni qual
(o
volta
un
enzima)
un recettore
presenta
(o un
un enzima)
unico sito
presenta
di binding
“n” per
siti di
il ligando
binding“s”
per il
ligando “s” (n≡coefficiente di Hill è un numero intero >1)
dp Vmax  s

dt
km  s
dp
dt
dp Vmax  s n
 n
dt k m  s n
dp
dt
s
Risposta iperbolica
s
Risposta sigmoide
Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di
signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una
risposta ultrasensibile ad un input.
Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà
Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di
signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari.
Fattore di Crescita
MAP chinasi
chinasi chinasi
raf
ATP
ADP
MAP chinasi
chinasi
Mek1
ATP
ADP
MAP chinasi
Erk1
Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?
% di S-P allo stato-stazionario
Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di
signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema.
Un esempio molto
comune di sistemi che
mostrano curve
stimolo-risposta
sigmoidi è
rappresentato dagli
enzimi cooperativi.
[kinasi] in multipli di EC50
Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo
di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima.
Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta
sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dall’equazione di Hill:
y = xnH/(EC50 + xnH)
Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello
stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione
Attività di Erk2
allo stato-stazionario
La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente
ultrasensibile
Erk2=MAPK
Mos=MAPKKK
[Mos] (nM)
La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un
incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione
massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte
Pertanto, c’è qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una
risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali.
La doppia fosforilazione avviene mediante una doppia collisione
MAPKK  P
MAPKK-P  P
MAPKKK
MAPKKK
MAPKK - P
MAPKK -PP
a)
La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK
b)
La seconda fosforilazione richiede una seconda collisione

allora la velocità di conversione della MAPKK fosforilata a doppiamente fosforilata
aumenterà con il quadrato della concentrazione dello stimolo
La reazione del secondo ordine si traduce in una curva stimolo-risposta ultrasensibile con
un coefficiente di Hill di 2.
Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata mediante un meccanismo a doppia
collisione.
Schema di una cascata di MAPK
L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK.
Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti.
Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e
E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP
rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente.
MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente
fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.
Cinetiche di ordine 1 e zero
Vero ordine zero per v=Vmax
v  Vmax
Vmax
v
[ S ]  k[ S ]
Km
a)
v in funzione di [S], per un ampio range di [S]
b)
v in funzione di [S], per un ridotto range di [S]
dove [S] << Km (~cinetica del 1° ordine)
c)
v in funzione di [S], per un range di [S] dove
[S] > Km (~cinetica di ordine zero)
Per semplicità si è plottato [S’], dove [S’]=[S]/Km
Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta
Sensibilità iperbolica
Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilazione:
un substrato S è fosforilato da una kinasi per ottenere S-P,
che può essere defosforilato da una fosfatasi per
riottenere S.
kinasi
fosfatasi
Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano
lontani dalla saturazione.
Velocità di reazione
3.5
3
2.5
3
2
1.5
2
[kinasi]
1
1
0.5
0
0
20%
40%
60%
80%
S-P come % di S + S-P totale
100%
Allora la velocità della reazione verso destra
(linea continua) diminuirà e quella verso sinistra
(linea tratteggiata) aumenterà, entrambe
linearmente (reazione del primo ordine)
all’aumentare della percentuale di substrato
fosforilato
Nel punto di intersezione delle linee tratteggiata
e continua il sistema è allo stato stazionario.
Raddoppiando la concentrazione della kinasi:  la pendenza della linea della reazione
verso destra raddoppia: v  k[kinasi ]
Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta
Sensibilità iperbolica
kinasi
Velocità di reazione
fosfatasi
Raddoppiando la concentrazione della kinasi la
pendenza della linea della reazione verso
destra raddoppia.
Adesso la velocità della reazione verso destra
sarà superiore a quella della reazione inversa, e
il livello di S-P aumenterà.
[kinasi]
S-P come % di S + S-P totale
Però, aumentando S-P la velocità della
reazione verso destra decadrà e la velocità
della reazione inverse aumenterà.
Verrà eventualmente raggiunto un nuovo stato
stazionario, con il punto di intersezione e la
percentuale di S-P allo stato stazionario
spostati a destra.
Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta
Sensibilità iperbolica
% di S-P allo stato-stazionario
Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario del precedente grafico in funzione della
[kinasi] si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica
[kinasi] in multipli di EC50
Il sistema è massimamente sensibile (la curva stimolo-risposta ha la massima pendenza) a
bassi livelli di stimolo, e diventa progressivamente meno sensibile all’aumentare dello
stimolo.
Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta
Ultrasensibilità a steps multipli
fosfatasi
[kinasi]
S-P come % di S + S-P totale
In una reazione di doppia fosforilazione a
due steps la velocità della reazione verso
destra aumenta con il quadrato
dell’ammontare di kinasi presente.

La pendenza della linea della reazione
verso destra varia con il quadrato della
concentrazione della kinasi presente
v  k[kinasi ]2
% di S-P allo stato-stazionario
Velocità di reazione
kinasi
[kinasi] in multipli di EC50
La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea
continua), con nH=2. La curva sigmoide ha
maggiore pendenza di quella iperbolica
(linea tratteggiata) per stimoli intorno alla
EC50, ma è meno ripida per stimoli molto
piccoli e molto grandi.
Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero
[kinasi]
S-P come % di S + S-P totale
Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente
saturati, le loro velocità non variano
linearmente all’aumentare di S-P: le rette
sono sostituite con curve iperboliche.
% di S-P allo stato-stazionario
Velocità di reazione
L’ultrasensibilità può anche insorgere quando la kinasi e la fosfatasi operano
vicino alla saturazione. In effetti le MAPK sono fisiologicamente presenti a
concentrazioni sufficientemente elevate da saturare parzialmente le MAPKK.
[kinasi] in multipli di EC50
La curva stimolo-risposta è sigmoide
(linea continua), con nH=2.5. La curva
iperbolica è rappresentata dalla linea
tratteggiata.
Interruttori di accensione e spegnimento
La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta
dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, c’è
anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il
mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca2+]
nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare.
Pertanto, ciò che andiamo cercando sono dei sistemi biochimici
in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e
spento (off).
In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono
operati da proteine G e/o da proteine di fosforilazione
Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche
Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è
lo stesso di quello delle proteine G monomeriche.
g
b
INATTIVA
Scambio del GDP
legato col GTP
GTP
a
GDP
GDP
GTP
a
ATTIVA
Pi
La subunità a si
riassocia a bg
a
GDP
La subunità a si
dissocia da bg
Attività
GTPasica della
subunità a
GTP  GDP+Pi
La subunità a attiva
può interagire con lo
step successivo della
catena di ì signalling e
attivarlo
Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche
Ras (p21ras) è un buon esempio per questo tipo di switch.
Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il
GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca
Il fattore di scambio
del nucleotide
guanidinico (GEF)
interagisce con ras
Ciò causa lo scambio del
GDP legato con il GTP
p21ras
GTP
INATTIVA
p21ras
ras attivata interagisce
con il componente
successivo della catena
di signalling e lo attiva
GDP
GDP
GTP
p21ras
ATTIVA
Pi
Ras GTPasi stimolata
dall’associazione con
la GTPase-activating
protein (GAP)
p21ras
GDP
L’attività GTPasica
intrinseca idrolizza il
GTP a GDP e Pi
Attivatori di ras
G-protein Exchange Factors (GEF)
L’attivazione di ras da
parte della CaMKII attiva
la via delle MAP chinasi
•SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella
regolazione della via della crescita cellulare MAPK/ERK.
ras raf
•eIF-2b (Eukaryotic Initiation
Factor
2) è richiesto per dare
ras
GTP
inizio alla sintesi proteica.
•Ras-GRF1.
CaMKII
Cascata delle MAP chinasi
•Recettori per fattori di crescita.
Risposta
Interruttori On-Off – Proteine di
fosforilazione/defosforilazione
Protein Kinasi – trasferiscono
un fosfato dall’ATP ad amino
acidi specifici
Protein Fosfatasi – rimuovono un
fosfato da specifici amino acidi
O-fosfoserina
O
C
C
NH
C
H
O
O-
C
O
C
Serina
C
Kinasi
Fosfatasi
ADP
O
C
NH
Fosforilazione
Pi
O-
C
C
O
P
O-
O-fosfoserina
P
O-
NH
ATP
O
O
O
C
C
NH
C
O
H
Serina
Defosforilazione
O
Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione
Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano specifici amino acidi
Amino Acido
Ser & Thr
Tyr
Thr & Tyr
(Doppia specificità)
Kinasi
Fosfatasi
Protein kinasi C
MAP kinasi
PP1
PP2A
Recettore per l’EGF
pp60c-src
CD45
MAP kinasi kinasi
AtDsPTP1
Meccanismi di Trasferimento dell’Informazione
Un cambiamento nello stato di attività di un
componente a monte porta ad un cambiamento
dell’attività di un componente a valle.
• Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso
è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del
target può aumentarne o diminuirne l’attività)
Secondi Messaggeri
Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti all’interno della
cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore
Fosfolipasi C b
Adenilato Ciclasi
In entrambi questi sistemi il legame di un
PIP
DAG
singolo ligando ad un recettore
produrrà
un gran numero di molecole di secondo
Attiva la Protein
a
GTP
Kinasi C
messaggero
PLC
Attivata dalla
Membrana
plasmatica
2
subunità a
di Gs
Attivata da recettori
legati a Gq
IP3
Induce un
aumento del Ca2+
citosolico
ATP
- AMPLIFICAZIONE
AMP ciclico
2P
un ruolo chiave
per i secondi messaggeri
i
Attiva la Protein
Kinasi A
PIP2 – fosfatidilinositolo difosfato
IP3 – inositolo trifosfato
DAG - diacilglicerolo
Amplificazione
una molecola
di ligando
1 recettore attiva
più proteine G
proteina recettore
AMPLIFICAZIONE
1
recettore-ligando
subunità a
di Gs
Adenilato
ciclasi attivata
Ciascun enzima X
produce molti secondi
messaggeri, ciascun
messaggero attiva 1
enzima Y
500
enzimi
Sono attivate 500 molecole di
trasducina
Sono attivate 500 molecole di
fosfodiesterasi
AMPLIFICAZIONE
AMPc
2ndi
Kinasi A
AMPLIFICAZIONE
Ciascuna kinasi A può
fosforilare e attivare
molte copie di enzima Z
Enzima Z
Ciascuna copia di
enzima Z produce molte
molecole di prodotto
500
Proteine G
Una molecola di rodopsina
assorbe un fotone
AMPLIFICAZIONE
Prodotti dell’
enzima Z
105
messaggeri
250
canali ionici
105-107
ioni
Sono idrolizzate 105 molecole di
GMPc
250 canali del Na
vengono chiusi
Viene prevenuto l’ingresso nella cellula di 106-107
ioni Na per secondo per circa un secondo
La membrana dei bastoncelli è
iperpolarizzata di 1 mV
Calcio – il messaggero universale
Il Ca2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel
citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca2+ è
alta fuori dalla cellula e all’interno di alcuni organelli
L’apertura rapida e transitoria di canali permette al Ca2+ di fluire nel
citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base
di un sistema di signalling ubiquitario
Calcio – il messaggero universale
L’attivazione della PLC porta
alla formazione di IP3 solubile in
acqua
DAG
PKC
PLC
L’IP3 si lega al recettore
per l’IP3 sul reticolo
endoplasmatico e apre un
canale del Ca2+ (che fa
parte del recettore)
La Calmodulina può
attivare pompe del Ca2+
sulla membrana
plasmatica abbassando la
[Ca2+] citosolico
Il Ca2+ rilasciato dal RE si
lega alle Calmoduline
permettendole di
interagire con altre
proteine e attivarle
kinasi
La Calmodulina può attivare pompe del
Ca2+ del reticolo endoplasmatico
abbassando la [Ca2+] citosolico
La Calmodulina attiva una vasta gamma di
proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti
Vie o Networks
Generalmente le vie coinvolgono una serie
di reazioni a cascata che portano ad un
flusso lineare dell’informazione
Esempi di vie
1) Vie delle Proteine G
2) Via di Ras–MAPK
I networks (reti) sorgono da interazioni in cui
un componente di una via regola l’attività di
una seconda via
La via Gq-PLC-b
Chinasi a cascata
L’attivazione di ras da
parte della CaMKII attiva
la via delle MAP chinasi
ras
ras
raf
GTP
Cascata delle MAP chinasi
Il Ca2+ si lega alle
calmoduline
CaMKII
Risposta
La Calmodulina attiva una vasta
gamma di proteine, p.es la kinasi II
calmodulina-dipendenti
Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk
A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica
possono interagire allostericamente con l’enzima stesso alterando la
conformazione dell’enzima e quindi la sua velocità di reazione.
Quando sono gli stessi substrato o prodotto dell’enzima ad interagire
allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a
feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto l’enzima, oppure
mediare un cross-talk tra vie metaboliche parallele.
Meccanismi a feedback
In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica
influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via
metabolica.
(A) Feedback negativo in un semplice schema
di reazione lineare. Il metabolita X è
trasformato in Y, a sua volta trasformato nel
prodotto Z. Z inibisce l’enzima E1 che catalizza
la reazione XY.
(B) Feedback positivo in un semplice schema
di reazione lineare. Il metabolita X è
trasformato in Y, a sua volta trasformato nel
prodotto Z. Z stimolsa l’enzima E1 che
catalizza la reazione XY.
Meccanismi a feedforward
In una interazione a feedforward, il prodotto di una reazione enzimatica
influenza l’attività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica.
Feedforward in uno schema di reazione
lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua
volta trasformato nel prodotto Z. X stimola
l’enzima E2 che catalizza la reazione YZ.
Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk)
Nel cross-talk il metabolita di una via influenza l’attività dell’enzima di
un’altra via.
molecole della matrice
fattori di crescita
kinasi 1
kinasi 2
kinasi 3
Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi
citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o
la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono
sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando
saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.
Segnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettori
Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la
proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione…
A
B
Il segnale A attiva una
chinasi…
chinasi
…che fosforila e inattiva il
recettore per il segnale B risultato – nessuna proliferazione
Se il ‘crosstalk’ lavora solo in una direzione (ad es. da A a B) allora il segnale A sarà
dominante
Se il ‘crosstalk’ lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi
fattori p.es.
Timing della percezione del segnale
Densità relativa dei recettori
Ampiezza relativa del segnale
Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può influenzare
cambiamenti sinaptici indotti da stimoli
In particolare, la capacità della PKC di regolare la MAPK e della MAPK di
regolare la PKC porta ad una interazione tra le due vie (feedback pos.)
B (basale) stabile
T (soglia) metastabile
A (attivo) stabile
MAPK vs PKC
PKC vs MAPK
• Il punto A rappresenta uno stato di attività alta sia per la PKC che per la MAPK,
mentre il punto B rappresenta uno stato di bassa attività.
• Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di stati stazionari. Un sistema dI
questo tipo è definito bistabile.
• Il punto di biforcazione T è importante perché definisce la soglia di biforcazione.
• Con A viene innescato un loop a feedback positivo che diventa indipendente
dall’attivazione del recettore.
Feedback negativo ed oscillazioni
• Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC) sono regolate
dalla via della PLC.
• L’AC è intimamente associata a siti di ingresso del Ca2+ nella
cellula.
• Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare insorgono a causa
di una inibizione a feedback dell’AC Ca2+-dipendente.
• Quindi il signalling dell’AMPc si interseca con il Ca2+
intracellulare ed estende le sue modalità di regolazione.
Feedback negativo ed oscillazioni
Il modello mette in relazione i livelli di AMPc e l’ingresso di Ca2+. L’AMPc attiva canali del Ca2+
(Y). L’ingresso di Ca2+ aumenta. Il Ca2+ intracellulare inibisce l’adenilato ciclasi (AC). L’effetto
complessivo è un loop a feedback negativo in cui l’AMPc inibisce la sua stessa produzione.
Oscillazioni nell’AMPc e nel Ca2+ sono sostenute dal loop a feedback negativo.
a ( AC )



AMP 


 cAMP
b( PDE )
Ca2

ext
e



Ca2 int


f
c


YC 
YO

d
h



AC 
AC *
g
Feedback positivo
Problema: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema
nervoso, partendo da molecole instabili?
Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo di
immagazzinamento di informazione.
• La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi.
• Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone
in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo.
• In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima
potrebbe durare a lungo.
In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe
durare a lungo.
Difficoltà: In realtà, l’emivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo
stato “on” dell’enzima.
Quesito centrale
È possibile costruire interruttori molecolari stabili?
Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di
immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben
note e in maniera estremamente semplice.
Interruttori molecolari bistabili
Reazioni in un interruttore bistabile.
•
•
•
•
L’interruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato
inattivo (K1) o in uno stato attivo (K*1p), e una fosfatasi.
La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione.
La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo)
o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale.
In assenza di attività della Kinasi-2, l’interruttore è descritto da quattro equazioni:
Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva
dK*1p/dt, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi.
Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1
attiva e inattiva.
Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten,
dove Km1 e Km2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi,
rispettivamente; C1 e C2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi,
rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi.
Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3.
Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione
di kinasi-1 attiva
Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nell’Eq. 4) e della fosfatasi
(termine di destra nell’Eq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K*1p/T).
•
•
In assenza di kinasi-1 fosforilata, la
velocità di reazione della fosfatasi è
zero.
All’aumentare di K*1p, la velocità di
reazione della fosfatasi aumenta fino
alla saturazione.
La velocità della reazione della kinasi1 aumenta all’aumentare di K*1p, ma
la velocità decresce nuovamente per
concentrazioni elevate di K*1p perchè
vi è poca proteina non fosforilata da
fosforilare.
Kinasi
Velocità (moli/l·10-8/s)
•
Fosfatasi
Grafico della derivata di K*1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K*1p/T.
La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (dK*pl/dt) è la
differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi.
Allo stato stazionario (equilibrio) sara:
I punti in corrispondenza di K*1p/T = 0 e di K*1p /T  0.74 rappresentano gli stati stabili.
Ad esempio:
• se K*1p /T > 0 ma < 0.22, dK*1p/dt è negativa e K*1p ritornerà velocemente a zero;
• se K*1p/T > 0.22 ma < 0.74, dK*1p/dt è positiva e K*1p/T aumenterà a 0.74,
• se K*1p/T diventa > 0.74, dK*1p/dt è negativa e K*1p/T scenderà verso 0.74.
Stati stabili
stato instabile
K*1p/T0.22
Affinchè uno stato sia stabile, deve
essere dK*1p/dt = 0 e d2K*1p/dt2 deve
essere negativa. Questa seconda
condizione è richiesta affinchè una
piccola deviazione da uno stato stabile
sia seguita da un ritorno spontaneo a
quello stato.
In questo esempio i criteri di stabilità
sono incontrati in due punti: K*1p/T =
0 e K*1p/T  0.74, mentre K*1p/T 
0.22 rappresenta uno stato instabile.
Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere:
dK*1p/dt = 0
e
d2K*1p/dt2 <0
d2K*1p/dt2
5
2
dK1p/dt & d K1p/dt
2
dK*1p/dt
0.22
0.74
[K1p]/[T]
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5
In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K*1p/T = 0 e
K*1p/T  0.74, mentre K*1p/T  0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile
Soluzioni dell’equazione differenziale:
per diverse concentrazioni iniziali di K1p*
stato stabile
(fosforil.)
0.22
stato instabile
0
stato stabile
(defosforil.)
[K1p*]/T
0.74
Tempo (s)
Le curve convergono verso i due punti stabili K*1p/T = 0 e K*1p/T = 0.74 a seconda che la
concentrazione iniziale (normalizzata) di K*1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22,
che rappresenta il punto di equilibrio instabile.
L’interruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno
Stimolo
Kinasi
Fosfatasi
Funzione
neuronale
Effetto della stimolazione
sull’interruttore
Stimoli di diversa ampiezza attivano la
kinasi-2 in modo graduale.
K*1p/T
K*2
(nM)
Tempo
L’attivazione risultante della kinasi-1 è
anch’essa graduale finchè la sua
attivazione diviene rigenerativa. Da
quel momento, l’attività della kinasi-1
rimane alta anche quando lo stimolo
verrà rimosso.
Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine
Terminale
presinaptico
Assone
Sinapsi
Terminale
postsinaptico
PSD
Spina
Ramo di un dendrite
La “densità postsinaptica o “postsynaptic density” (PSD) è una zona specializzata
densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica.
• La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie del SNC, consiste di recettori ionotropici,
proteine di sostegno e del citoscheletro, e molecole di signaling.
• Tali proteine creano un microdominio di signaling, che traduce inputs presinaptici in risposte
postsinaptiche.
• Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA, mediano la la trasmissione
eccitatoria rapida.
Na+
Na+
NMDAR
NMDAR
AMPAR
Mg++
Glutamato
AMPAR
NMDAR
NMDAR
AMPAR
AMPAR
Glutamato
Potenziamento
Potenziale d’azione
Potenziale d’azione
Trasmissione Sinaptica
Mg++
Ca++
I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica,
che a sua volta aiuta l’apertura dei recettori NMDA a generare l’ingresso di Ca2+
che innesca cascate di signaling.
Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica
di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria.
Corrente postsimnaptica
Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+
0
Tempo (min)
60
Bliss & Lomo J Physiol, 1973
Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica
Corrente postsimnaptica
Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+
con un inibitore
della CaMKII
non c’è LTP
0
Tempo (min)
60
Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998
*CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?)
Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es.,
fosforilazione di recettori AMPA  risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato
fosforilazione
AMPAR
*CaMKII
Processi
di rilascio
**CaMKII
NMDAR
LTP
Ca++
** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)
Premessa
La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per l’induzione di LTP
La protein kinasi II Ca2+/calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una
posizione ideale per giocare un ruolo chiave nell’LTP, essendo virtualmente in grado di
indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica.
• L’ingresso transiente di Ca2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante l’induzione
dell’LTP, stimola l’autofosforilazione persistente e l’attivazione della CaMKII.
• L’attivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un
interruttore bistabile responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi.
Obiettivo
Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la
CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante l’attività delle
fosfatasi endogene.
Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente
La CaMKII è una proteina multimerica in cui l’oloenzima è costituito da 8 a 12 subunità,
ciascuna delle quali ha un’attività kinasica.
Ciascuna subunità è fosforilabile e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla Thr286.
La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD
da proteine strutturali.
Un oloenzima = 8/12 subunità
Un dominio autoinibitorio
occupa e blocca il sito catalitico.
La Ca2+/calmodulina rimuove il
dominio autoinibitorio dal sito
catalitico causando fosforilazione
e attivazione.
Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le
subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste
strutture ad anello si realizza l’autofosforilazione mediante un processo in cui una subunità
fosforila quella accanto.
H2N
CATALiTICA
AUTOINIBITORIA
CaM
ASSOCIAZIONE
ALLE SUBUNITA’
COOH
Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1 nel PSD
La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato attivato (“on”) nel quale la maggior parte delle 8/12
subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (“off”) nel quale esse
sono quasi completamente defosforilate.
Stato “off”
Stato “on”
Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore
che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca2+ intracellulare?
L’operazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca2+.
(1) Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il
legame di due molecole di Ca2+/calmodulina: una per attivare la subunità catalitica della
CaMKII, e l’altra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato.
Po
Po C
PoC2
P1C2
C= complesso Ca2+-calmodulina
Po=oloenzima non fosforilato
P1=oloenz. fosforil. una volta
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v1. dipenderà dalla seconda potenza della
[Ca2+/calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca2+]:
(1)
v1 = velocità di inizio dell’autofosforilazione per sito (subunità)
k1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare
KH1 = [Ca2+]50 per l’attivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984)
[Ca2+]i a riposo (100 nM) << KH1  l’inizio procederà lentamente alla [Ca2+] di riposo.
(2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione
della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca2+]in, dal momento che è
richiesta solo una molecola di Ca2+/calmodulina per esporre la Thr286 della subunità
che funge da substrato.
P1
P1 C
P2
(2)
velocità di autofosforilazione
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v2, della CaMKII parzialmente
fosforilata sarà superiore a v1, in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca2+]:
6.E-07
v1
4.E-07
v2
2.E-07
0.E+00
0
0.04
0.08
[Ca] (m icroM
0.12
(3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1
tenuta nel PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto
non sono in grado di funzionare nella PSD.
La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten:
SP = subunità fosforilata
S = subunità defosforilata
E = fosfatasi
Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata, v3, sarà:
(3)
k2 = costante catalitica della PP1
KM = costante di MM
ep = concentrazione di PP1 attiva*
Pi = concentrazione dell’oloenzima fosforilato i-volte.
Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD all’interno del
quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM.
Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la
loro concentrazione sarà molto più alta della KM della fosfatasi (1 μM), e vi sarà
saturazione della fosfatasi.
Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore
• Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti
disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta.
• Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è
saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire).
• Lo stato “off” è pertanto stabile poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII
per sito è bassa rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.
• Questa situazione è ribaltata nello stato “on”.
• In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una
calmodulina per la reazione (2).
• D’altro canto, l’alta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la
velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa.
• Lo stato “on” è quindi stabile essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per
sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.
La simulazione mette in evidenza l’esistenza di un sistema bistabile a [Ca2+]in
basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nel PSD
Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione
intracellulare di Ca2+.
Vi sono due livelli stabili (punti neri) di
fosforilazione a [Ca2+]in basali (linea verticale). Il
sistema è bistabile in un ampio intervallo di
[Ca2+]in (area ombreggiata).
Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di
Thr286 fosforilati dopo che il 20% dell’oloenzima
della CaMKII nello stato “on” altamente
fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non
fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a
spingere il sistema nello stato “off”.
Il passaggio del sistema allo stato “off”
richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al
di sotto del livello marcato con il punto giallo
(punto di equilibrio instabile).
NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.
Un aumento della [Ca2+]in aumenta la frequenza di autofosforilazione.
Se la [Ca2+]in è quella basale (bassa), il
grado di fosforilazione allo stato
stazionario della CaMKII è basso
(cerchio nero nel grafico).
Successivamente, un ingresso di Ca2+,
causato ad es. da stimolazione elettrica,
può muovere transitoriamente la
[Ca2+]in verso destra, a valori molto più
elevati.
Un aumento della [Ca2+] aumenta la frequenza di autofosforilazione.
Se la [Ca2+]in rimane per un certo tempo
elevata, a destra della regione grigia,
l’autofosforilazione farà saltare
stabilmente l’attività della CaMKII da
un livello basso ad uno alto (cerchio
nero nel grafico).
Successivamente, quando la [Ca2+]in
ritorna a livelli basali, lo stato della
CaMKII si riduce, muovendosi verso
sinistra. Ma l’attività della CaMKII
permane comunque ad un livello alto,
con sostenuta autofosforilazione.
FINE