Lezione 19 - 20
martedì 3 maggio 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
vettori con integrazione
vantaggi : controllo di espressione e funzione con
ripetibilità
Svantaggi : più laboriosi per selezionare
l’integrazione
Mediazione da sistemi semplici di procarioti o lieviti
Ricombinazione random e specifica
Dalle Cellule procariotiche alle eucariotiche
Trasfezione transiente
trasfezione stabile
trasfezione stabile = ricombinazione stabile
Ricombinazione random
ricombinazione sito specifica
Obbiettivo: riuscire ad avere una espressione o un KO di
un gene in condizioni controllate
Vettore classico per integrazione sito
specifica
modello :
 omega ma non è l’unico
modello n. 4 Giuditta
QuickT ime ™e un
dec ompr esso re TIFF ( Non co mpre sso)
son o nece ssar ip er visu aliz zar e ques t'immagine .
Quick Time™e u n
de compr ess ore T IF F (Non c ompr esso )
so no nec essa ri per v is ualizzar e que st'immag in e.
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Perché Omega
Sono stati fatti vari modelli:
over
O circolari con un solo X-
Non ci sono grandi differenze di efficienza misurata sulla
ricombinazione omologa sul gene per la
HPRT ipoxantina-tioguanina fodforibosil-transferasi
omega : le due spalle per la ricombinazione omologa
neo
tk

a
b
frequenza di ricombinazione
Frequenza di ricombinazione bassa ~1x10-6
Il metodo è possibile applicarlo solo con numeri grandi di
cellule su cui fare una selezione per selezionare i ricombinanti
Cellule eucariotiche in coltura (almeno 50-100 x 106 )
Metodo essenziale per avere animali transgenici KO
o knock - in
solamente se sono disponibili metodi per avere gameti o
cellule staminali totipotenti trasformabili col vettore per
ricombinazione omologa
Cellule embrionali ES di topo
Solo da quando sono state disponibili in coltura le cellule
embrionali staminali di topo è stato possibile provare a fare
la ricombinazione omologa per avere topi transgenici
ricombinanti su sito specifico
Topi transgenici precedenti erano solo per inserzione
random e quindi solo per espressione di geni esogeni o
sovrannumerari
Si ottengono solo eterozigoti
Il topo transgenico nato da trasformazione della blastocisti
è sempre eterozigote
sia con ricombinazione random che sito specifica
Inutile cercare di ottenere doppi ricombinanti
più semplici da ottenere con un incrocio tra soggetti della
progenie di un fondatore transgenico controllato
Ciambelle senza il buco
Quando non si vede l’organismo transgenico
Gene dominante letale
Assenza di fenotipo con l’eterozigote
Necessità dell’omozigote
L’omozigote solo per incrocio mai su tentativo con
blastocisti dell’eterozigote,
La probabilità di un secondo evento omologo è
assolutamente improponibile
Necessità di una strategia alternativa
Riuscire ad avere mutanti condizionali:
Nel momento giusto e nel tessuto giusto
Un sistema con controllo spazio - temporale
Esiste?
Benemerito chi l’ha inventato
Applicazione da un sistema procariotico del fago P1
A cosa serve come si applica
Da un sistema procariotico ad uno eucariotico
Attuare o far avvenire la ricombinazione al momento voluto
Ricombinazione: applicazione più usata per fare delezioni
Si può anche fare inversione, integrazione o scambio
Il metodo deriva dal meccanismo di azione dell’enzima CRE
(enzima che crea ricombinazione)
Come avviene la ricombinazione, è l’enzima che è specifico
e che riconosce la sequenza lox su cui inerviene
Ricombinazione tramite siti specifici Lox P
Cre-lox sito specifica
Modello di taglio e
giunzione dei due
filamenti di DNA di un
sito lox P
Swapping model
Modello di scambio
Modello di ricombinazione
Intermedio cruciforme
isomerizzazione
intermedi
(A) Schematic drawing of the Cre−loxP site-specific recombination pathway,
based on the strand-swapping model (Nunes-Düby et al., 1995) and on Cre−loxP
structural models (Guo et al., 1997; this work). Conserved tyrosine residues from
two of the four recombinases in a synaptic tetramer cleave the DNA backbones of
the recombining segments to form transient 3'-phosphotyrosine linkages. The
released 5'-hydroxyl ends of the cleaved DNA undergo intermolecular nucleophilic
attack of the partner phosphotyrosine linkages to complete the exchange of one
pair of strands and form a Holliday intermediate. A second round of cleavages and
strand exchanges using the remaining two recombinase subunits and the
complementary DNA strands gives recombinant products. (B) Sequences of loxP
and loxS6 DNA duplexes used to design the HJs HJ1 and HJ2. HJ1 and HJ2 are
shown in the same orientation as in Figure 3. For HJ1, the strand-bridging arms I
and II contain the wild-type loxP sequence and the strand-bridging arms III and IV
contain the loxP complementary sequence. Bases that are not related by twofold
symmetry and prevent branch migration are highlighted in yellow. Vertical lines
indicate missing phosphates in the DNA backbone. The 13 bp inverted repeat
binding sites for Cre recombinase are underlined and the 6 bp crossover region
between cleavage sites are in bold. For both the Cre−HJ1 and Cre−HJ2
complexes, an additional 5'-overhanging thymidine residue was found to facilitate
crystallization.
Modello cre-lox
Struttura cruciforme
di Holliday
ricombinase
Cre =
Creating
Recombination
enzyme
Lox taglio e riunione
Modello cruciforme
Modello interazione CRE
Ricombinazione tramite Cre Lox
intramolecular deletion
a
b
inversion
c
a
tandem
a
c
palindrome
c
a
b
a
b
d
c
b
c
scambio su cromat. fratelli
a
a
a
c
c
b
b
c
intramolecular deletion / duplication
a
b
integration
c
inversion
intramolecular deletion
a
b
a
c
c
a
b
a
b
c
a
d
c
a
Lox site
b
c
a
a
Come
funziona
Cre-Lox
c
c
b
b
c
intramolecular deletion / duplication
a
b
integration
c
Mutanti condizionali
Il sistema cre-lox
Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox
e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che
perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre.
Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due
introni diversi) all’esterno del gene da eliminare, oppure della
regione da eliminare. Si chiamano floxed gli esoni o le regioni
da excidere.
Si rende attivo per interference un vettore con tandem che
diventa plindrome per inversione Cre-Lox.
Con questa strategia si possono ottenere cellule o topi
transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto
con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può
far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove
si esprime o dove si induce Cre.
Il costrutto per il gene floxed
costrutto
esone x
induz. di Cre
ricombinaz.
e delez. neo
esone y
esone x
introne x
loxP - neo - loxP
neo
esone x introne x
loxP
esone z
gene tk
loxP
loxP - neo - loxP
ricombinaz.
omologa
costrutto
ricomb.
introne x
esone z
esone y
gene tk
loxP
esone y
esone z
loxP
gene tk
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule
sensibili al Ganciclovir
Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le
cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico
Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene
Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti (si
possono usare cellule con doppia resistenza)
Topi transgenici mutanti condizionali
Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene e’la
possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo.
- una soluzione per questo problema potrebbe essere l’induzione della
mutazione tempo e tessuto specifica
- e’ stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox
utilizzato anche in biologia cellulare perche’ inducibile
- Cre e’ la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover
in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri
- i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale
di 8bp
- la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox
allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in
palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se
c’e’ un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si
integra (vedi fig. 1)
Applicazioni del metodo Cre-Lox
- Questa tecnologia e’ applicata alle cellule staminali di topo ES.
- L’inserzione dei siti LoxP si deve far avvenire tramite gene-targeting
con un costrutto specifico (i costrutti con i geni con le regioni
fiancheggianti che contengono siti LoxP si chiamano “floxed”)
- quando si esprime il gene Cre avviene la ricombinazione e se si esprime
solo in un tessuto la mutazione diventa tessuto specifica e si puo’ seguire
il destino delle cellule che lo vanno a formare, per esempio nelle cellule
pancreatiche quelle che formeranno le cell. a e b
- l’espressione del gene Cre non sempre e’ omogenea nel tessuto e la
ricombinazione avviene a mosaico non nel 100% delle cellule
- come controllo si usano due geni reporter, per cui se si ha
ricombinazione il primo fiancheggiato da due siti Lox (lacZ) si inattiva e
si attiva il secondo gene reporter (di solito la GFP o la fosfatasi alcalina)
L’introduzione delle cassette per la resistenza ed i siti LoxP si fa avvenire
per ricombinazione omologa
Condizioni di funzionamento
Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al
momento giusto e nel posto giusto
Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule
epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi
Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al
ligando (ligand binding domain LBD) dell’ormone degli estrogeni, in
modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche’ non viene
somministrato l’ormone sintetico che riconosce il recettore e fa
traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove
induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP
(vedi esempio della figura precedente)
CRE LOX
Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con “Gene Targeting”
sito e tempo specifici.
(Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e P.Chambon
- limitazioni del Gene targeting : l’assenza della funzione colpita
(targetet) da mutazione durante le fasi di sviluppo puo’ risultare letale
precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi iniziali e successivi
a quello letale.
- molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule durante
l’ontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca fenotipi
complessi e complica l’individuazione di cellule anomale prodotte da
fenomeni con piu’ cause.
-l’effetto di una mutazione puo’ essere compensata durante lo sviluppo
manca il fenotipo alterato nell’animale adulto.
-Per famiglie di geni si devono mutare piu’ geni della stessa famiglia per
prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude
l’identificazione di una funzione di un componente della famiglia genica.
Geni pleiotropici
- Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo’ essere
ancora piu’ complicato quando la famiglia e’ coinvolta in un sistema
pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per l’acido
retinoico o FGF.
- Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il
rischio di danno sulla fertilita’e disordini sistemici.
- In tutti questi casi sara’ problematico determinare la funzione di un
gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo.
- inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni
somatiche come il cancro
- Quindi la necessita’ di avere un metodo con l’inattivazione
condizionale di un gene e’ molto forte
Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in
topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito
specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1.
CRE-LOX ed RNA interference condizionale
Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of
gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp 1443-8 P.J.Paddison et al.
- mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori
- knock out per ricombinazione
- anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore)
- RNA antisenso trascritto da un vettore
- oligo antisenso
Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in
certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in
dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della
interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce
l’RNA specifico del messaggero in frammenti.
E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre
un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso
Soppressione stabile dell’espressione genica tramite RNA
interference in cellule di mammifero
Sistema cellulare di
difesa antivirale
dimerizzazione
PKR
fosforilazione
Blocco non
specifico della
traduzione
EIF2a
(kinasi)
dsRNA
esogeno
(~ 500 bp)
attiva
Cofattore per la ribonucleasi
non - specifica (Rnasi L)
2’- 5’ oligodenilato
polimerasi
pcDNA3
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
ZEO r
Gene per la resistenza alla
zeocina;
L Lox P;
GFP
Le prime 500 bp codificanti di
enhanced gr. fluor. prot. EGFP;
P
Promotore di
citomegalovirus;
Modello per interferenze con Cre-Lox
P
GFP
ZEO
r
L
GFP
L
Ricombinasi CRE
P
GFP
ZEO
ZEO
r
L
GFP
L
r
dsGFP
Rapporto FF:REN
Espressione di CRE
Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in
cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN
ds = double strand
FF = firefly luciferase
REN = renilla luciferase
ss = single strand
as = antisense
Approccio olistico globale allo
studio della biologia
Sviluppo del metodo riduzionistico incapace
di sviluppare lo studio delle interazioni
multiple tra le funzioni cellulari
nuove tecniche nuovi vettori
Dall’inizio dei progetti di sequenziamento dei Genomi di organismi
eucariotici e’ iniziato un nuovo tipo di approccio per lo studio delle
funzioni ed interazioni dei geni.
Abbiamo visto nel modello murino
- la possibilità di studio di funzione dei geni durante lo sviluppo con il
metodo di knock-out con la ricombinazione omologa.
- la possibilita’ di studiare le interazioni a livello di famiglie di geni.
-i nuovi metodi per lo studio di interazioni tra proteine con geni
reporter e geni regolatori della trascrizione.
- metodi per individuare proteine che legano altre proteine col metodo
del doppio ibrido (variante della complementazione con un gene
reporter)
Sistemi multifattoriali
E’ sempre più necessario poter studiare la funzione di gruppi di geni
per le molte funzioni ed interazioni che esistono, per cui ogni gene può
intervenire in molte funzioni indipendenti ed il cnock-out di un singolo
gene può provocare una cascata di eventi, quello che poteva essere
definito come l’assenza di un unico fenotipo.
In patologia una sindrome è data da un insieme di sintomi che possono
essere appunto spiegati con le molte interazioni ed i molti effetti che
può provocare la disregolazione di un gene.
Andate a rivedere cosa sono gli effetti di EPISTASI E PLEIOTROPIA
Ricerca di geni nuovi tramite mRNA di fusione
Quindi sono stati sviluppati due approcci nuovi per la ricerca di nuovi
fenotipi ed espressione di molti geni :
la conoscenza delle sequenze di molti geni coinvolti nel controllo di
funzioni complesse come quelle che regolano la divisione cellulare, la
morte cellulare e le corrispondenti vie di trasduzione dei segnali con le
regolazioni fini ed i processi di stimolazione o inibizione hanno aperto la
necessità di studiare molti geni coinvolti e la variazione di espressione.
Un metodo per cercare geni nuovi in vivo non era stato ancora inventato
L’approccio completamente nuovo e’ stato quello del “gene trapping”
(l’acchiappa geni) per poter individuare molti geni contemporaneamente.
Per poter studiare contemporaneamente l’espressione di molti geni è
stato inventato il metodo dei macro e micro arrays.
Gene trapping “l’acchiappa geni”
Idea luminosa sempre per fare topi transgenici:
Creare un vettore per integrazione random che possa
esprimere la resistenza solo se genera un mRNA di fusione
Premessa: non è detto che dalla conoscenza della intera
sequenza genomica si possa dedurre in maniera completa
quali siano tutti i geni attivi e anche tutti gli eventuali splicing
alternativi a carico dei geni ed in tutti i tessuti
Come deve essere fatto un vettore del genere?
Tutte queste tecniche sono state sviluppate a partire dall’idea di vedere
in maniera olistica, cioe’ con un approccio globale come i geni
interagivano nel complicato network cellulare.
Le interazioni cellulari ed intercellulari hanno la possibilita’ di essere
studiate non piu’ con un approccio semplice di inerazione un gene una
proteina ed una funzione, ma molti geni con le loro interazioni mediate
dagli enzimi a tutti i livelli a partire dalla trascrizione, dalle interazioni
a livello nucleare, citoplasmatico di membrana, di trasporto e di
secrezione e quindi le interazione con altre cellule.
I macro e poi micro-arrays mettono a disposizione su supporti di vario
tipo centinaia di geni selezionati e a volte in toto per vederne
l’espressione.
Nel caso di patologie in cui non sono ancora conosciute le cause
dell’attivita’ degenerativa di geni coinvolti, si possono vedere le
differenze tra l’espressione dei geni in condizioni normali e
patologiche e quindi i geni che sono attivati o spenti per il cattivo
funzionamento del gene/geni scatenanti la patologia.
Per esempio nel caso delle neoplasie i fattori coinvolti partecipano al
controllo della vita cellulare nei vari punti di vitali/essenziali del
controllo delle attivita’ cellulari.
L’approccio globale puo’ far vedere i geni a monte ed a valle coinvolti
ed il punto di mancato funzionamento all’interno della complessa
macchina.
Nel sistema immunitario in cui si conoscono decine di fattori come le
interleukine / chemochine con i rispettivi recettori cellulari si possono
vedere a livello di patologie le reti interattive che ancora non erano state
descritte.
La possibilita’ di vedere la funzione di nuovi geni che ancora non sono
stati descritti per la precisa attivita’ può essere data dalla conoscenza a
livello di genoma della struttura a cui adesso si puo’ attribuire una
funzione generalmente per omologia con altre strutture note.
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608611: Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse
embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al.
Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random
con vettori per geni reporter o selezionabili.
-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni
successivamente clonabili,
-espressione solo se l’inserzione avviene in introni; mi
permette di individuare esoni o promotori di geni attivi e non
restringendo/selezionando il tipo di geni marcabili
-finqui’ non esisteva automazione per l’identificazione dei
geni bersaglio che possono non essere trascritti e se ne può
individuare anche la regione 5’non tradotta,
Per ottenere questi obbiettivi sono stati sviluppati due nuovi vettori per
GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20
Gene trapping = metodo basato
sull’uso di cellule staminali
Le cellule embrionali staminali totipotenti di
topo dal momento in cui sono state coltivabili
sono state usate per ottenere topi transgenici
La prima utilizzazione è stata quella della ricombinazione
omologa con cnock-out di un gene.
Il “genetrapping” è un nuovo metodo che permette il cnock-out di
geni che si esprimimono o no in “embrional stem cells” ES
utilizzate per ottenere topi transgenici.
Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608611: Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse
embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al.
Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con
vettori per geni reporter o selezionabili.
-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivam. clonabili
-espressione solo se l’inserzione avviene in introni, esoni o promotori di
geni attivi restringendo il tipo di geni marcabili
-finqui’ non esiste automazione per l’identificazione dei geni bersaglio
che possono non essere trascritti o corrispondono alla regione 5’non
tradotta,
Per superare questi limiti sono stati sviluppati due nuovi vettori per
GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20
VICTR3 VICTR20
Quali sono i costituenti di questi vettori:
2 componenti : a) acquisizione di sequenza con il promotore della PGK
(fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES, fuso alla Puromicina Nacetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)
b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter (colorimetrico)
con sito polyA (SAbgeobpA o SAIRESbgeobpA gene di fusione
b
neomicina)
Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere
marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di
fusione e ricerca in banca dati del gene.
Controllo HPRT
Esperimento di controllo sulla funzionalità di questo tipo di vettori
-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD (fosfoglicero Kin.,
puromicina, splice donor site) per cercare un gene target per
eccellenza: il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina
fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell’ introne II. (I
geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita’ al terreno
HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt produce
resistenza alla 6-thioguanina).
Le sequenze della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato
l’integrazione nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica
del costrutto.
L’integrazione del vettore al 3’ del gene HPRT produce cellule
sensibili al terreno HAT e resistenza alla 6-thioguanina dando il gene
di fusione con il 3’ ed utilizzando il sito poly A+ del gene endogeno
HPRT.
Gene trapping tramite Victr 3 e 20
vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per
l’integrazione nel genoma ospite)
LTR
VICTR3
VICTR20
LTR
PGK
SA IRES geo
puro
pA
SD
PGK
LTR
puro
SD LTR
Wild-type locus
SA IRES geo pA
AAAAAn
PGK
G
LTR
puro SD LTR
AAAAAn
G
Mappa del vettore VICTR20 per ricombinazione nel gene Hprt
clonato nel vettore pRIV6.9I nel sito EcoRI
HindIII
LTR
targeting vector
LTR
probe
WT HPRT
2
H
3
H4
7.1 kb
targetet allele
2
Southern blot Hind digest
6TG 6TG wt
wt
LTR
H
LTR 3
9.2 kb
H 4
Studi preliminari hanno mostrato che vettori con il modulo SAbgeobpA
sono in grado di creare alleli “nulli” inattivando i messaggi endogeni.
In questo esperimento sono stati provati VICTR20 e PGKpuroSD per
mutagenizzare il gene HPRT selezionando per la 6-thioguanina resist.
Il vettore PGKpuroSD non ha dato colonie resistenti (controllo con Southern)
Nuovo esperimento di controllo con elettroporazione del plasmide
PGKpuroSD o infettando le cellule staminali ES con il retrovirus
prodotto con la linea cellulare ricombinante di MoMLV per
impacchettare VICTR3 e VICTR20.
- trasduzione - selezioni di cloni puromicina +
- isolamneto dell’ RNA e 3’RACE - sequenziamento 80-700 bp dal 75%
dei cloni analizzati manualmente e 60% dall’analisi (automatizzata) robotica
- creazione della banca dati con questi cloni = Omnibank seq. tags OST
-confronto con la GeneBank (versione 100) e SwissProt (vers.34) con Blast
RISULTATI = P<10-30; 18% geni noti; 10% ESTs umani e roditori;
10% ripetiz. B1, B2 e trasposoni; 61% sequenze sconosciute
Controllo per dimostrare l’efficienza dei cloni OSTs a
individuare il gene raggiunto ed il sito di integrazione del retrovirus
- analisi Southern per individuare l’inserzione nel gene tirosin-kinasi di
Bruton (btk locus) la sequenza cominciava con l’esone 2 indicando
l’inserzione del vettore nel 1 introne di btk.
- analisi con 3 enzimi di restrizione ha confermato questa ipotesi (fig 3)
Controllo dei siti di integrazione
- confronto della seq. cDNA dei cloni OSTs con 108 geni noti: 44%
inseriti nelle 350 basi al 5’ dei geni; 12% al 3’ di cDNA codificanti.
Benche’ il vettore potrebbe favorire regioni 5’ ma integra ovunque.
Il vettore dovrebbe integrare in tutti i geni e non solo in quelli espressi in
cellule ES, infatti il gene btk si esprime nei linfociti B. Per RT-PCR si
trova in cellule della milza, ma non in cellule ES.
- sequenziamento di 3000 OSTs ha dimostrato che solo il 10% contiene
il vettore dopo il sito SD esogeno. 61% degli OSTs sta in geni trascritti.
- analisi di espressione per RT-PCR di 37 OSTs (17 elettropor. 20 infez.)
34 sono espressi in cervello, testicoli, ES o embrione 10.5 g
Costrutti
VICTR3 VICTR20
2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK
(fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina Nacetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)
- b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter
(colorimetrico) con sito polyA (SAbgeobpA o SAIRESbgeobpA)
Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere
marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di
fusione e ricerca in banca dati del gene.
-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della
Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per
ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi
mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin
and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza
della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione
nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.
Race per gene trapping
gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno
geni attivi e non attivi.
Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare
RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver
individuato la regione.
Ulteriore dimostrazione che i cloni OSTs corrispondono a sequenze
esoniche e non a RNA nucleari non maturi sono stati fatti i Northern di
poly A+ RNA di molti tessuti e ibridati con 16 probes OSTs sconosciuti
dando 14 segnali positivi confermando la presenza di questi geni.
Siccome i prodotti di 3’ RACE tendono ad essere piu’ lunghi degli OST
iniziali, e’ stato fatto il sequenziamento aggiuntivo di 290 OSTs con 70700 bp in aggiunta per media di 263 bp.
- la nuova analisi Blast sulla GenBank mostra 27% di geni noti (43 noti e 34
ESTs) questo rinforza il fatto che i vettori si inseriscono in sequenze
trascritte. Le sequenze OST hanno media di 500bp con 74% geni ignoti
Un limite di questo metodo come della selezione di cloni EST e’ la
sottorappresentazione dei geni poco espressi o transienti in tessuti
limitati.
Comunque i metodi di “gene trap” non sono senza pressioni selettive per
il disegno, veicolazione, grandezza del bersaglio e accessibilita’ del
gene, però i risultati dimostrano un largo spettro di eventi indipendenti.
Adesso si può sapere la sequenza di ingresso del vettore ed il gene
mutato da cui ottenere il topo transgenico.
costrutti per gene trapping
PT1 b geo lacz neo
ei
b geo
ee
pA
ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon
bgeo = lac z - neo fusion
pA poly adenilation signal
U3 b geo
U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk
Sup 5 E. coli sup F tRNA
b geo
U3
b geo
RU5
Sup 5
U3
RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer
TS4
sa
Lac Z
P-neo
RU5
Topi transgenici di III e IV
generazione
I- iniezione DNA blastocisti
II- embrional staminal cells e ricomb. omologa
III- mutanti condizionali Cre-Lox e promot.
tessuto specif. e inducibili
IV- costrutti con cromosomi artificiali BAC,
embrioni tertraploidi
V- gene trapping libraries of ES cells
combinazioni di vettori BAC floxed knock-in
Race per gene trapping
gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno
geni attivi e non attivi.
Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare
RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver
individuato la regione.
Topi transgenici che esprimono
Cre
Controllo dell’espressione di Cre tramite
promotore tessuto specifico
Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6)
il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum)
Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) bgal si colora in
blu perché libera l’espressione eliminando un gene floxed interposto tra
il promotore e LacZ.
• http://authors.elsevier.com.
http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi