Diagnostica di laboratorio per
autoimmunità non organo specifica:
tecniche analitiche ed interpretazione
dei risultati
Dott.ssa Anna Maria Girardi
Diagnostica e Ricerca San Raffaele
LaboRaf
PREMESSA
• La presenza di autoanticorpi è riscontrabile in un
elevato numero di patologie, sia d’organo che
sistemiche
• La corretta identificazione degli autoanticorpi
associati ad un certo quadro clinico fornisce
informazioni utili dal punto di vista sia diagnostico
che prognostico
• Soprattutto per le malattie sistemiche, il singolo dato
di laboratorio non è sempre di univoca interpretazione
e necessita, spesso, di ulteriori approfondimenti.
• Autoanticorpi organo
specifici
• Autoanticorpi non
organo specifici
• Organo bersaglio,
presenza di anticorpi,
alterazione della
funzione d’organo: la
sequenza appare ovvia,
la richiesta del clinico è
mirata, l’interpretazione
del dato di laboratorio è
semplice
• Sintomi comuni a
diverse patologie,
anticorpi diretti verso
strutture ubiquitarie, il
substrato utilizzato per
la ricerca spesso non ha
relazione con l’organo
più colpito dalla
patologia,
interpretazione del dato
di laboratorio è più
complessa
EMA su esofago di scimmia
Le principali patologie autoimmuni
sistemiche
•
•
•
•
•
•
•
•
Lupus eritematoso sistemico (LES)
Sclerosi sistemica(SSc)
Dermatomiosite/polimiosite
Sindrome di Sjogren
Sindromi da sovrapposizione (overlap) MTCD
Vasculiti
Artrite Reumatoide
Sindrome da anti fosfolipidi
I più comuni esami disponibili per la
ricerca di autoanticorpi non organo
specifici
•
•
•
•
•
•
•
Anticorpi anti nucleo (ANA)
Anticorpi anti DNA nativo (dsDNA)
Anticorpi anti antigeni nucleari estraibili (ENA)
Anticorpi anti granulociti neutrofili (ANCA)
Anticorpi anti proteine citrullinate (CCP)
Anticorpi anti Istoni
Anticorpi anti fosfolipidi*
Tecniche analitiche disponibili
•
•
•
•
•
•
Immunofluorescenza indiretta
ELISA
Immunoblot
RIA
(Immunodiffusione)
Controimmunoelettroforesi)
• Citofluorimetria
• Microarray
Immunofluorescenza indiretta
• Incubazione del siero, opportunamente diluito, su
un substrato ricco dell’antigene bersaglio
• Lavaggio con tampone per eliminare gli anticorpi
non specifici, quindi non legati all’antigene
• Incubazione con anticorpo anti immunoglobuline
IgG (IgA) umane coniugato con Isotiocianato di
fluoresceina
• Lavaggio con tampone
• Al microscopio a fluorescenza le strutture dove si
sono formati complessi antigene anticorpo
appaiono colorate in verde
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA PER
ANA
• Test di screening: immunofluorescenza indiretta su
coltura di cellule epiteliali (Hep2) alla diluizione 1:80
• Titolazione: diluizioni successive fino alla scomparsa
della fluorescenza
• Identificazione e descrizione
fluorescente osservato
del
tipo
o
“pattern”
• In caso di positività è opportuno procedere con esami di
secondo livello: ricerca di anticorpi anti DNA , ENA
• Solo in rarissimi casi pazienti negativi per anti-nucleo
risultano positivi per anti DNA o ENA
• Limite del metodo: l’esperienza dell’operatore
ANA
test di primo livello
• Da eseguire in immunofluorescenza indiretta su
cellule Hep2
• Individuabili più di 30 pattern nucleari e
citoplasmatici
• Vi è associazione significativa con alcune patologie
autoimmuni
• Compaiono precocemente nella malattia
• Talvolta precedono i segni clinici
• Da valutare con cautela: i bassi titoli, il dato isolato
• Non sempre l’entità del titolo correla con
l’andamento della malattia
• La titolazione è comunque utile per individuare altre
specificità presenti
Da ricordare: anticorpi anti nucleo a basso titolo
possono essere presenti
•
•
•
•
In soggetti sani
In gravidanza
Nelle donne >40 anni
Negli anziani
• In alcune neoplasie
• Nell’insufficienza renale
• In alcune infezioni virali (mononucleosi, AIDS)
WHO 66/233 (1:80)
L’immunofluorescenza
indiretta, se effettuata in
un “sistema” ben
controllato consente
• Di individuare un gran
numero di autoanticorpi
nucleari e citoplasmatici
• Di individuare anticorpi
diretti verso antigeni
espressi solo in
determinate fasi cellulari
• Di rilevare la presenza di
anticorpi presenti in
concentrazioni molto
basse
lamine nucleari
periferico
omogeneo
Granulare (speckled)
Speckled & fuso
lisosomi
ribosomi
Omogeneo+
speckled+
nuclear dots
Fuso mitotico
Anticorpi anti DNA
• Farr (RIA): il “gold standard”. Rileva anticorpi ad
alta affinità. Indaginoso, è poco usato per motivi
pratici.
• Immunofluorescenza indiretta (su Chritidia
Luciliae). Altamente specifico, rileva anticorpi ad
alta affinità. Limite: qualitativo.
• ELISA: sempre più utilizzato. Vantaggio:
quantitativo. Limite: a volte ad un’alta sensibiltà
si contrappone una minore specificità. Si
possono riscontrare falsi positivi anche
utilizzando antigeni ricombinanti.
• Immunoblot : non soddisfacente
• Citofluorimetria : ancora risultati scadenti
• Microarray: in fase di sperimentazione
ANTICORPI anti-DNA NATIVO - double stranded
DNA ( test di secondo livello)
• Uno dei criteri diagnostici per il LES secondo
l’American College of Rheumatology
• Prevalenza variabile nel LES dal 40 all’80%;
raramente presenti ad alto titolo in altre
patologie (IgG)
• Il titolo segue l’attività della malattia
ENA
test di secondo livello
• Sono antigeni nucleari (proteine associate al DNA o
all’RNA) o citoplasmatici
• La presenza di anticorpi verso uno o più di questi antigeni
caratterizza il profilo sierologico della malattia
• Hanno notevole specificità per alcuni quadri clinici
• Hanno notevole significato diagnostico e prognostico
• Compaiono precocemente
• Non è necessario un risultato quantitativo (tranne semmai
che per RNP): la quantità di anticorpi determinabili non
correla con l’andamento della malattia
ENA
metodiche disponibili
•
•
•
•
•
•
•
Immunodiffusione doppia
Controimmunoelettroforesi
ELISA
Immunoblot
Dot blot
Citofluorimetria
Microarray
ENA: nessuno è perfetto
• ELISA: molto sensibile, a volte poco specifica.
Grandi differenze qualitative tra i prodotti in
commercio
• Immunoblot: non adatto per tutti gli antigeni
• (Immunodiffusione: specifica, con sensibilità
buona, ma difficile da interpretare : in disuso)
• (Controimmmunoelettroforesi: lunga e
complessa. Poco usata)
• Citofluorimetria, microarray: ancora da
perfezionare
• In conclusione: l’optimum sarebbe poter
utilizzare sempre due metodiche
Immunoblot
• Proteine estratte da cellule Hep2 vengono separate
con SDS PAGE
• al termine dell’elettroforesi le proteine, separate in
base al peso molecolare, vengono selezionate e
trasferite su nitrocellulosa in base a pannelli predefiniti
• il siero in esame viene posto in incubazione sulle
strisce pretrattate: eventuali autoanticorpi si legano agli
specifici antigeni. La loro evidenziazione avviene con
un siero anti-immunoglobuline umane coniugato con
enzima.
• La reazione con il substrato evidenzia la presenza di
bande, che vengono confrontate con quelle ottenute da
sieri di riferimento su una striscia di controllo
I = Controllo positivo.
II= Controllo negativo
III= Campione positivo per
SSA ed SSB
ELISA
• Per gli ENA esistono buoni kit in
immunoenzimatica
• La determinazione quantitativa
non è in realtà necessaria
• Risultati più affidabili se il coating
delle piastre è fatto con l’antigene
specifico piuttosto che con un pool
di antigeni (ENA screening”)
Vi è notevole incertezza nel definire quale sia la
modalità migliore per la preparazione degli antigeni
ENA:l’utilizzo degli Ag nativi consente il mantenimento
dei principali epitopi conformazionali, ma la
preparazione è costosa e complessa.Quanto alle
metodiche impiegate, quelle in cui l’antigene è allo
stato nativo sono quelle a più bassa sensibilità e a più
alta specificità.
Biochip
Citofluorimetria
Le più autorevoli associazioni operanti nel campo
dell’ Autoimmunità (FIRMA, SiMeL, AMCLI..)
propongono linee guida per la diagnostica
autoimmune:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Per raggiungere la migliore accuratezza diagnostica
Per fornire al clinico informazioni precise
Per inquadrare il più possibile il paziente
Per limitare incertezze e dubbi in un campo in cui sovente
le patologie hanno un esordio subdolo
e nel contempo
Per limitare gli sprechi dovuti a richieste non appropriate
Per ridurre il carico economico sia sul paziente che sulla
Regione in un percorso diagnostico che richiede esami
spesso costosi
Per utilizzare al meglio le risorse umane e tecniche
Il percorso dovrebbe essere condiviso dai clinici e dagli
specialisti di laboratorio
Esistono Linee guida per
•
•
•
•
•
ANA
DNA
ENA
ANCA
ANTICORPI ANTI FOSFOLIPIDI
Esistono percorsi diagnostici
suggeriti per la ricerca di
autoanticorpi
• Nelle connettiviti sistemiche
• Nella celiachia
• Nelle vasculiti
• Nel diabete mellito di tipo I
SOSPETTO di LES ?
Ab anti-nucleo
presenti >1:80
no
LES
improbabile
si
Pattern:
Omogeneo (DNA)
Periferico (DNA)
Granulare (RNA)
Granulare atipico (PCNA)
Ab anti-DNA
ENA
+
A titolo elevato
possibile LES
+
SM
PCNA:
probabile
diagnosi
di LES
SSA SSB
RNP:
associazione
anche con
altre patologie
LES
pattern
antigene
omogeneo/
periferico
DNA
istoni
elevata
LES da farmaci
RNA: Sm
SS-A
elevata
lupus discoide
granulare
specificità
SS-B, RNP
granulare atipico
(pleomorfico)
PCNA
citoplasmatico
denso
proteine ribosomiali
elevata
elevata
omogeneo
Sm?
PCNA
SCLEROSI SISTEMICA
pattern
antigene
nucleolare
RNA polimerasi
fibrillarina
SS-A SS-B
granulare
omogeneo e
elevata
nucleolare
DNA topoisomerasi (SCL70)
centromerico
centromero
specificità
elevata
Pm/Scl
elevata per
CREST
SINDROME DI SJÖGREN
pattern
granulare
nucleare atipico,
puntiforme (nuclear
dots)
apparato mitotico
antigene
RNA: SS-A SS-B
specificità
frequente
**blocco cardiaco fetale
Apparato di Golgi
Nuclear dots
midbody
POLIMIOSITE - DERMATOMIOSITE
pattern
citoplasmatico
elevata
(non presenti ANA)
omogeneo e
nucleolare
antigene
specificità
tRNA sintetasi (Jo1)
Pm/Scl
JO1
MALATTIA MISTA DEL CONNETTIVO (MCTD)
pattern
granulare
antigene
RNP
specificità
presenti a concentrazione
più elevata che nel LES
Seguire le linee guida
Dare al paziente ed al clinico le informazioni appropriate
Contenere i costi ed i tempi
ARTRITE REUMATOIDE
La presenza di alcuni autoanticorpi è comune in
molti pazienti con Artrite Reumatoide. Tuttavia:
• sono presenti a basso titolo (ANA, DNA)
• sono generalmente poco specifici, ad eccezione degli
anticorpi
anti
proteine
citrullinate.
Se
la
determinazione è effettuata con test di terza
generazione, la specificità risulta del 98% con una
sensibilità fino al 70%
• l’introduzione di tali test in combinazione con il
Fattore Reumatoide può essere un utile strumento per
la diagnosi precoce: alcuni studi suggeriscono che la
presenza di tali anticorpi sia
un marcatore
prognostico
Sindrome da anticorpi antifosfolipidi
• Sintomi- criterio:
• Trombosi vascolari
• Patologie ostetriche
• Test criterio:
• LAC
• Anti Cardiolipina
• Anti Beta 2 Glicoproteina
Criteri diagnostici
•
•
•
•
LAC positivo
Anti Cardiolipina IgG/IgM positivo *
Anti Beta2 Glicoproteina IgG/IgM *positivo
Positività ad uno dei test in due determinazioni ad
almeno 3 mesi una dall’altra
• (*: eseguito con ELISA standardizzato; valutare
con attenzione basse positività))
• All’aumentare del numero di test positivi aumenta
il rischio di eventi tromboembolici
VASCULITI ANCA - ASSOCIATE
Granulomatosi di Wegener
Sindrome di Churg-Strauss
Poliangioite microscopica
• Gli ANCA sono generalmente assenti in alcune
vasculiti primarie dei vasi di medio e grosso calibro:
poliarterite nodosa, arterite temporale, arterite di
Kawasaki, Takayasu, malattia di Bechet.
• In presenza di manifestazioni cliniche che
suggeriscono la diagnosi, il riscontro di ANCA ha
elevata sensibilità (>80%) e specificità (>95%)
ANCA metodiche disponibili
• Immunofluorescenza indiretta su granulociti
umani fissati in etanolo
• ELISA (PR3)= fluorescenza citoplasmatica
(c ANCA)
• ELISA (MPO)= fluorescenza perinucleare (p
ANCA)
• Immunofluorescenza indiretta su granulociti
fissati in formalina
Per una corretta diagnostica degli ANCA
• Screening su granulociti fissati in etanolo
• Per i positivi (sia con pattern citoplasmatico
che perinucleare)
• a) ELISA (proteinasi 3, mieloperossidasi)
• b)Immunofluorescenza indiretta su granulociti
fissati in formalina. I positivi presentano
sempre fluorescenza citoplasmatica
VASCULITI ANCA ASSOCIATE
pattern
perinucleare / nucleare
citoplasmatico
principale antigene
MPO (mieloperossidasi)
PR3 (proteinasi 3)