Lez 13-14 IngGen 24_XI_06
Race e nested PCR
Date degli esami sessione invernale
- scritto 18 Gennaio 2007; orale 24 Gennaio 2007
- scritto 15 Febbraio 2007; orale 21 Febbraio 2007
Regole per disegnare i primers
Ricapitoliamo le regole essenziali
Escludere dai primers:
- terminazioni AT o GC che si possono ripiegare
- palindromi interne e tantomeno alle estremità
- terminazioni complementari nella coppia di primers
(formazione di dimeri di primers)
Preferire nei primers:
- terminazioni 3’ in G o C che favoriscono un legame più forte
- la lunghezza dei primers generalmente tra 15 e 25 bp (salvo
eccezioni motivate)
- T°C “melting” omogenee per la coppia di primers (calcolo T
“melting” 4 °C per G/C ; 2 °C per A/T
- T “annealing” 5-6 gradi sotto la T “melting”
Altre regole di scelta primers
Paradossalmente si potrebbe pensare che un primer più
lungo sia più specifico
Invece ha più probabilità di trovare regioni omologhe
all’interno del genoma da cui amplificare
Dopo la scelta confronto dei primers contro le sequenze
genomiche per analizzare possibili appaiamenti spuri
5’
3’
3’
primer
templato
5’
È più efficiente l’omologia di un primer al 3’ che al 5’
5’
3’
3’
templato
5’
Informazioni che caratterizzano una PCR
Informazioni sulla sequenza da amplificare, conoscenza della
sequenza
Caratterizzazione dei primers e dell’amplicone:
- scegliere i primers secondo i criteri necessari (si indicherà la
lunghezza di ognuno e dove mappano sulla sequenza di
riferimento dal nucleotide x al nucleotide y per ognuno dei
due)
- di conseguenza si identifica l’amplicone la cui lunghezza
sarà contata dal 5’ del primo nucleotide del primer frw al 3’
dell’ultimo nucleotide del primer rev (dato che i primers
vengono incorporati dalla polimerasi)
1° nucleotide
5’ del primer
amplicone
ultimo nucleotide
3’ del primer
Correzione parametri di una PCR
La PCR deve dare dei prodotti che approssimano gli attesi
Quando i prodotti non corrispondono agli attesi:
Smear - poca specificità nonostante i primers specifici
- si gioca sulla temperature di “annealing”, temp.
su
- cicli troppo lunghi rendono aspecifica l’amplificazione
Bassa amplific. - stringenza “annealing” alta, temp.
giù
- ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension
Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,
Aggiustare il protocollo
Dopo le evidenze sperimentali si ottimizza il sistema con
ritocchi empirici del protocollo
Se la lunghezza dell’amplicone è diversa dall’atteso:
- sbaglio sul genoma o sul calcolo
- polimorfismo
Accertamento tramite sequenziamento della corrispondenza
dell’amplificato
In caso di polimorfismo va dimostrato e si deve clonare e
osservare su un certo numero di genomi
Eliminare la possibilità di errore,
ripetere l’esperimento con altri DNA
Controlli della PCR
Controlli di estrazione: quali?
- ripetibilità della amplificazione
- ripetibilità su campioni indipendenti
- univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato
Controlli di contaminazione: quali?
- a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione
- assenza di amplificazione su a.
- b. assenza di amplificazione
su tutti i prodotti di reazione della PCR:
primers
taq polimerase
nucleotidi
tampone
acqua di diluizione
Principi della RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends)
La RACE è una tecnica per l’amplificazione di sequenze
nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben
definita regione interna ed una sua estremità (3’ o 5’).
Questa tecnica, nota anche come “one-sided” PCR o “anchored” PCR,
puo’ essere considerata una variante della più classica PCR.
LIMITE PRINCIPALE
La RACE richiede almeno una regione a sequenza nota e interna
all’mRNA che si vuole tipizzare.
Cosa serve per fare la RACE
Un aiuto non indifferente è dato:
Dalle banche EST (expressed sequence tag);
Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER
TRAPPING);
Dall’IBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente
e/o funzionalmente.
Race ricerca del 3’ ignoto
5’ noto
mRNA
3’ ignoto
3’
poly A
TTTTTT
5’
sintesi del I filamento di cDNA con RT con
primer oligo dT
trattamento con RNase
PCR con primer frw. noto e primer rev. con
coda aggiunta
TTTTTT
5’
5’ noto
3’
TTTTTT
3’
5’
3’ ignoto
prim.frw
prim rev.
Scelta dei primers per la RACE 3’
Il primo primer obbligato è quello per la RT (poly T)
Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve
essere specifico
regione nota
cDNA
regione ignota
TTTTT
3’
5’
primer specifico
Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare
dei prodotti anche aspecifici.
Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per
aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto
specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?
RACE 3’
1 - Annealing tra la coda di polyA dell’mRNA e un primer contenente una
coda di oligo(dT) all’estremità 3’ e retrotrascizione
5’
5’
3’
mRNA
poly(A) tail
AAA….AAAn
TTT…..TTT
5’
AAA….AAAn
TTT…..TTT
Alla facile degradabilità dell’RNA;
All’alta probabilità di avere un RNA con
strutture secondarie;
Alla bassa specificità di questa fase;
5’
Race fasi successive
2 - Degradazione del templato di RNA
3’
TTT…..TTT
5’
3 - Amplificazione per PCR usando un primer specifico del gene (GSP)
ed uno specifico alla nuova estremità 5’(AUAP o UAP)
3’
GSP
TTT…..TTT
…e la
specificità???
5’
UAP
AUAP
gsp = gene specific primer
Uap = universal amplification primer
Auap = abridget univ.ampl. primer
Specificità GSP2
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un
secondo primer gene specifico (GSP2)
GSP 2
5’
3’
TTT…..TTT
3’
5’
UAP
- SEQUENZIAMENTO DIRETTO;
- CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO;
- STUDI FUNZIONALI;
AUAP
I primers UAP e AUAP servono per avere
delle T melting su cui disegnare i GSP
Nested PCR o PCR interna
regione nota
cDNA
3’
regione ignota
TTTTT
I primer specifico
5’
II primer specifico
Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione
interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella
regione nota dell’ mRNA
La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al
primo primer,
-si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione,
-probabilità alta di avere un frammento specifico
- probabilità bassa di due sequenze omologhe limitrofe due
volte nel genoma.
- si può ricorrere ad un terzo primer interno.
cosa è una“Nested” PCR
Per aumentare la specificità con PCR ottimizzata e non
ulteriormente ottimizzabile con i parametri di reazione
Se si deve avere un prodotto di amplificazione con alta
efficienza eliminando altri prodotti indesiderati
-a) omologia parziale dei primers già ottimizzati
-b) sequenze omologhe, pseudogeni, sequenze duplicate
caso a: trovare una seconda coppia di primers interni al
primo amplicone (probabilità limitata di omologia
di entrambe le sequenze in una stessa regione)
caso b: cercare le regioni divergenti dove scegliere altre
coppie di primers
II amplicone interno
primer frw. I
primer frw. II
primer rev.II
primer rev.I
PCR nested primo esempio
Quando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp
5’ pr frw 3’
5’
3’
3’
3’
pr rev
5’
5’
1° amplicone
II pr frw
5’
3’
3’
5’
II pr rev
2° amplicone nested
il secondo amplicone sarà più breve secondo la posiz. dei primers
PCR nested RACE 3’
Nel caso di una RACE 3’ cambia solo il verso dei primers interni alla regione
nota ed il primer del 3’ ignoto può essere anche un poly T con una coda per
avere una T° melting più consona ai primers interni
seq nota
mRNA
5’
AAAA 3’
RT reverse trascrittasi
cDNA
3’
I filamento
TTTT 5’
RACE 3’
3’
5’
I filamento
TTTT 5’
II filamento
AAAA 3’
I prim
II prim
Solammente il primer della seq
nota si può cambiare con un
secondo più interno
prim esterno con coda
eventuale
TTTT
amplicone finale contenente il 3’ ignoto
RACE 5’ Cerchiamo il 5’ ignoto
Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli
stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del
3’ ignoto. C’è anche la possibilità di fare la RT direttamente
con un primer noto. L’unico problema è che pochi sono gli
enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è
possibile che il primer specifico non faccia una RT molto
specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i
messaggeri.
Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come
spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei
primers con una coda che possono aumentare l’efficienza
rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers
interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3’.
Race 5’ fase I
1 - Annealing tra una regione interna dell’mRNA e un primer gene specifico
(GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random).
5’
mRNA
poly(A) tail
AAA….AAAn
GSP1
GSP1
NON deve essere interno o sovrapposto
ad introni;
NON deve avere una Tm molto alta
(lavora circa a 42°C);
NON deve avere una bassa specificità o
omologia con altri geni;
Race 5’ fase II
2 - Retrotrascrizione e tailing all’estremità 3’ del cDNA
5’
5’
3’
AAA….AAA n
GSP1
3’
5’
GSP1
Degradazione
Purificazione del
cDNA
3’
CCC….CCC
5’
GSP1
Race 5’ fase III
3 - Amplificazione per PCR usando un secondo primer specifico al gene
(GSP2) ed uno contenente una coda di oligo(dC) all’estremità 3’
5’
3’
GIG…..GGI
CCC….CCC
5’
GSP2
GSP1
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un altro primer gene
specifico (GSP2)
5’
3’
GIG….GGI
CCC….CCC
GSP3
GSP2
3’
5’
race 5’ignoto
5’
mRNA
poly A
Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript.
3’
primer rev. specifico
rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH-
5’
3’
cDNA singolo filamento
3’
5’
trattamento con RNase
trattamento con terminal transferase
CCCC
3’
cDNA singolo filamento
primer frw di poly G
CCCC
3’
c c cc c c
c c c c 5’
sintesi secondo filamento
5’
cDNA singolo filamento
primer rev. specif.
PCR selettiva
Race 5’ ricapitolazione
dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal
transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno
5’
3’
CCCC
3’
GGGGG
CCCCC C
II primer rev. spec.
interno (nested)
I primer rev. specif.
5’ sconosciuto
II primer rev. spec.
interno (nested)
Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita’ coesive per
restrizione dell’adattatore o con A-T
5’
Clonaggio dei prodotti PCR
Clonaggio in plasmidi dedicati di prodotti PCR
con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuri
TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”
Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.
Esistono in vendita:
- plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la
ligasi tra l’amplicone ed il plasmide
- plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide
che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi