ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI
ANATOMIA PATOLOGICA
ESAME ISTOLOGICO :
ESAME CITOLOGICO :
•
esame estemporaneo
mediante uso del criostato
•
esame su versamento
interstiziale
•
biopsie mirate su tessuti e\o
su organi
•
esame su urine
•
esame su striscio vaginale
prelievi autoptici
•
agoaspirato
•
•
1
FASE PROPEDEUTICA
•
2
FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
•
3
FASE PRE-ANALITICA
•
4
FASE ANALITICA
•
5
FASE POST-ANALITICA
•
6
FASE INTERPRETATIVA
•
7
REFERTAZIONE
1
FASE
PROPEDEUTICA
CITOLOGIA :
ISTOLOGIA :
•
richiesta esame da reparto
o
divisione
ospedaliera
interna o da medico esterno
•
richiesta esame da reparto
o
divisione
ospedaliera
interna o da medico esterno
•
allegate notizie cliniche e
patologiche
circa
la
motivazione della richiesta
di esame
•
allegate notizie cliniche e
patologiche
circa
la
motivazione della richiesta
di esame
•
contestuale invio di reperto
anatomico
o
istologico
(vetrini di consulenza)
•
•
esecuzione autopsia e relativi
prelievi effettuata dal medico
anatomo-patologo
contestuale invio di campione
citologico o di vetrino con
striscio vaginale già eseguito
dal ginecologo
•
(preparazione ed anamnesi
del paziente sottoposto ad
agoaspirato
in
apposito
ambulatorio)
2
FASE PROPEDEUTICA DI
LABORATORIO
ISTOLOGIA :
•
ricezione biopsie e reperti
•
classificazione e numerazione reperti
registro interno annuale progressivo
•
compilazione apposito modulo di profilo mirato
•
riduzione reperti anatomici ad opera del medico
apposite cassettine per istologia
•
procedura di
fissazione dei tessuti
automatico (autotecnico) (circa 15 h.)
•
(accensione e preparazione del criostato negli esami
estemporanei)
su
apposito
in
in processatore
3
FASE
PRE - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• inclusione in paraffina
precedenza fissati
• preparazione
microtomo
termostatato stendi-sezioni
dei
reperti
e
in
bagno
• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su
vetrini; loro fissazione in stufa a secco
termostatata;
procedimento
deparaffinazione in solventi
• (per esame al criostato : riduzione reperto e
taglio sezioni
con
loro
immediata
fissazione in metanolo)
4
FASE
ANALITICA
ISTOLOGIA :
• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni
su vetrino
• colorazione di routine E.-E.
• colorazioni speciali
• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica
• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo
• (colorazione esame criostato)
• Controllo di qualità :
• uso di sezioni già risultate positive in qualità di
controllo positivo
• controlli inter-laboratorio
5
FASE
POST - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• apposizione etichette identificative sui vetrini
contenenti le sezioni colorate
• archiviazione in apposite rastrelliere delle
cassettine
per istologia
contenenti le
inclusioni in paraffina
• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e
dei moduli di profilo mirato al medico
anatomo-patologo specialista
• archiviazione dei
istoteche
vetrini
diagnosticati
in
6
FASE
INTERPRETATIVA
ISTOLOGIA :
• osservazione
ottico
dei
vetrini
al
microscopio
• interpretazione e diagnosi da parte
medico anatomo-patologo specialista
del
• refertazione su apposito modulo di profilo
mirato e relativa consegna in segreteria
amministrativa
• Controllo di qualità :
• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e
medico revisore
• lettura alla cieca inter-laboratorio
7
• refertazione
su
amministrativa
REFERTAZIONE
apposito
modulo
in
segreteria
• archiviazione documentazione cartacea
• inserimento su personal computer del referto in archivio
informatico dedicato per singola area di interesse (istologia;
citologia; immunopatologia)
• archiviazione documentazione informatica
• consegna del referto dalla segreteria al reparto o al
medico richiedente o al paziente
DOPO IL PRELIEVO
• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e
come.
• -Tessuti sotto vuoto
• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.
FISSAZIONE DEI TESSUTI
• La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della
morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare
nello statu quo ante migliore possibile la struttura del
campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi
una immagine statica, la quale, benché non ne
rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo,
deve tuttavia essere costantemente riproducibile.
Requisiti fondamentali del fissativo ideale :
• sicura preservazione della morfologia di base
• integrità della struttura antigenica
• impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per
aggiunta o sottrazione di componenti chimiche
• opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.
Fissazione
Definizione
Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla
stabilizzazione di componenti tessutali con minima
dislocazione ed estrazione dei composti nativi
La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il
più possibile simile alla condizione vitale
Fissazione
Una fissazione ideale prevede:
• Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da
trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina
• Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo
( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )
• Riproducibilità del processo di fissazione nonostante
differente composizione del tessuto
• Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di
componenti native
• Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )
• Assenza di “sovra-fissazione”
Fissazione dei Tessuti
• Molto importante è lo spessore del campione di tessuto
che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che
al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi
prima dell’arrivo del fissativo.
• Una buona fissazione, atto preliminare più importante della
tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto
dipende:
- dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato,
- dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto
- dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione
• In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e
sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso
molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e
possono diffondere nell’acqua.
Fissazione
Classificazione
I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:
1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con
nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine
che reagiscono una con l’altra formando aggregati
MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria
3 Modi:  movimento termico con distruzione della struttura
secondaria e terziaria (calore)
 repulsione elettrostatica tra parti diverse di una
stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)
 rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)
La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per
Cross-link
Fissazione
2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati
tra
polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine
vicine
STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina
E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile
Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE
Utile anche in ME, Istochimica
FISSAZIONE DEI TESSUTI
Tecniche di fissazione :
• per immersione, consistente nel sommergere il tessuto
nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo
tra fissativo e campione di 10 : 1
• per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di
vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da
esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi
integri
• per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano
grazie ai vapori che si liberano da una soluzione
fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in
situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili
possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano
fissativi
altamente
volatili
come
:
formaldeide,
glutaraldeide, acido osmico.
Fissazione dei Tessuti
La Formalina:
E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore
di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed
idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di
penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi
idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di
tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)
• Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione
acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10
(detta anche formaldeide 4%)
• Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl +
900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la
coartazione ed il rigonfiamento cellulare
• Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml
di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico
anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto
alla trasformazione della formaldeide in acido formico),
mantenendo il pH a 7.0.
Modi di Applicazione ( 1 )
Immersione
Il campione deve essere immerso in almeno
20 volte volume di fissativo
Ottima fissazione se:
• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)
• minimo intervallo tra asportazione e immersione
(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,
non sono più ossigenate e muoiono in un tempo
variabile)
Modi di Applicazione
Immersione
Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )
e le dimensioni.
Importanti le indicazioni sul recipiente
(non sul coperchio)
Nome, data, Numero; provenienza
Modi di Applicazione ( 2 )
Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida
(aldeidi)
Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns
Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della
adeguata concentrazione nel tessuto.
Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta
dipende da:
• Concentrazione
• Temperatura
• Natura dl fissativo
• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo
• Tipo di tessuto
• Cross Link o coagulazione
Modi di Applicazione ( 3 )
Esposizione di cellule e tessuti disidratati
(liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad
elevata temperatura ( 80°c )
Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare
amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)
Fissazione dei Tessuti
Fissativi alcolici
• Alcool etilico 95°
• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti
• Alcool metilico
• Alcool metilico ed acetone anaparti
L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la
moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per
istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva
coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e
coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce
utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un
fissativo più efficace ed omogeneo.
Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in
egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in
citologia.
Fissazione dei Tessuti
Miscele fissatrici a base di alcool:
• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool
etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si
aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale
• Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool
etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di
acido acetico glaciale
• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool
etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti
di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%
Fissazione dei Tessuti
Miscele fissatrici a base di acido picrico:
•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di
acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di
formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale
•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool
etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido
acetico glaciale ed 1 g di acido picrico
Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la
presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo
ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA
e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle
calcificazioni presenti.
Rischi e precauzioni d’uso per i
fissativi
Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per
inalazione e contatto.
Uso di cappe aspiranti.
Alcool : Rischio incendi
Glutaraldeide
Ac. Picrico
Sali di Mercurio
Tetrossido di Osmio
Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.
Tempi d’uso per i fissativi
Formaldeide 4% (= Formalina 10% )
Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24
Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da
3h a 24h
Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi
Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti
piccoli ( diam 1-2 mm)
INCLUSIONE DEI TESSUTI
Tecnica di inclusione in paraffina :
• Si effettua di routine su campioni privi di problemi
particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono
solubili e si asportano dai tessuti i grassi.
• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è
chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che
devono essere disidratati con immersione in alcool
etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della
paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di
venire impregnati in essa e successivamente inclusi in
blocchetti.
• In genere, il processo di inclusione avviene mediante
l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore
notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per
ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il
tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi
microtomi.
Disidratazione
ETANOLO
METANOLO
ACETONE
PROPANEDIOLO
Chiarificazione
XILOLO
BENZOLO
CLOROFORMIO
Inclusione
Paraffina
Gelatina / Agar
Celloidina
• Idrosolubili
Resine
(Metacrilati)
• Epossidiche
Congelamento dei tessuti
•
Effetti del congelamento
Sostanze “Protettive”
• Glicerolo / DMSO
• Blocchi di metallo
• Produzione di “Neve CO2”
•
Metodi di congelamento
• Ghiaccio secco
• Appar. Termo-elettrici
• Gas liquidi (N2)
METODO IDEALE
FREON
ISOPENTANO
Conservazione di
tessuti e cellule
METODI RAPIDI
Metodo
T (°C)
Efficienza
a
Tessuti
in liquidi
refrigerati
Tessuti
in contatto di
metalli
refrigerati
Fluido organico
In gas liquido
(N2)
- 196
Il più veloce
Fluido organico
In ghiaccio secco
Liquido organico b
- 79
Ottimale per la
maggior parte delle
applicazioni in M.O
Raffreddamento
Termo-elettrico
- 40
scarsa
Supporto metallico
Raffreddato per
conduzione
- 30
scarsa
a
a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano
b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone
Sezionamento
Rischio
• Microtomo
• Criostato
ambientale
•
Temp. ideali per i vari
tipi di tessuto
•
Lama
•
Tratt. delle sezioni
1) Essicamento (+ fissazione)
2) Freeze drying o altri metodi
• Ultra-microtomia
M.E.
Freeze – Drying
(Liofilizzazione)
• Principi
• Condiz. di congelamento
• Applicazione ai tessuti
• Condiz. di liofilizzazione
Temp.
Tempo
Trappola di N2O
• Trattamento successivo
Inclusione in paraffina
Fissazione in vapori
Freeze – Sobstitution
SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI
Tecnica di preparazione
delle sezioni in paraffina,
di circa 3 µ, per
essere
colorate :
E’ un procedimento atto
ad
assicurare
che
la
paraffina, non miscibile con
acqua ed alcool, venga
eliminata
ed il tessuto
possa essere impregnato
dal colorante. Quindi è
necessario utilizzare dei
solventi della paraffina ed
idratare gradualmente il
tessuto sino
all’
H2O
distillata. Nel caso in cui il
colorante sia in soluzione
alcoolica ci si arresta all’
alcool 95°.
•
xilolo
5’
•
xilolo
5’
•
xilolo
5’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 95°
5’
•
etanolo 70°
5’
•
etanolo 50°
5’
•
H2O distillata ––›
•
––› colorazione
Colorazione dei tessuti
• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O
/ - S/ -NH3)
• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi
• Ionico (Salino – elettrostatico)
• Tipo di legame
tra colorante e tessuto
• Covalenti (tra non metalli = elettroni
condivisi tra due atomi)
• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff
(atomo centrale con 1 o 2 legami)
es Ag. Diammina
• Intermolecolari (van der Waal)
Colorazione dei tessuti
• Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)
• Basofile
• Componenti tissutali
• Acidofile
• Neutrofile
• Coloranti
• Cationici (basici)
• Anionici (acidi)
COLORANTI : DEFINIZIONE
CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm)
Criteri di purezza
Spettro
Gruppi cromofori
-N  -N azo
N = O nitroso
N - O2 nitro
NOMENCLATURA
c=c
alkene
c=o
oxo
(gruppi auxocromi)
es: -SH
coloranti
NITRO
AZO
CHINONICI
Pratica di colorazione dei tessuti
Reattivi
Purezza
Technical quality
Purified / Pure / Very pure
Analytical grade
Acqua
Etichetta sui reattivi
Conservazione
Scarto / Scaricamento
Coloranti
(Assorbimento
Coloranti cationici
colore osservato)
Nuclei / Batteri
pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di
fosfato DNA / RNA (selettivo)
es. col. GRAM
ZIEL-NIELSEN
+ Cresyl-violetto + I2
- col. Rosso = Fucsina
Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
· EMATEINA
ossidazione di ematossilina
Compl. con AL
Fe
EMALLUME
(Mayer - Carazzi)
EMAT. HARRIS - Lillie
progressive - Differenziazione
Ematossiline
regressive
- pH
Colorazione dei tessuti
Reazione di Blocco
• Ossidazione
-
Ossidanti
Deboli
H2O2 / I2
Medi
Ac. Perform.
Forti
Permanganato
• Riduzione
• Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)
• Saponificazione (idrolisi di derivati acidi
• Deaminazione
COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA
Ematossilina - Eosina
•
sezioni in H2O distillata
•
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
7’
•
lavare H2O di fonte
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
lavare H2O di fonte
10’
10’
•
Eosina [0.25 %], acidificata
con qualche goccia di
CH3COOH
1’
•
lavare in H2O distillata
2’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso
Colorazione con coloranti basici
La colorabilità dipende da vari fattori:
• pH
• disidratazione
• fissazione
• temperatura
Colorazione con coloranti basici
• pH della soluzione
• Tipo di colorante
Dipende da:
• Tempo e temperatura
• Tampone
• Trattamento dopo la colorazione
Meccanismo:
• Aggregati di coloranti legati a
gruppi acidi
• Legame ionico + f. van der Waal
es. Blu di Toluidina
Metacromasia
Visibile
U.V.
Alcool
resist.
+
-
PAS
H
C
OH
H
C
OH
H
C
O
H
C
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ALCIAN BLU pH 2.5”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare in H2O distillata
5’
•
soluzione Alcian blu 8 GX
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
[1% in CH3COOH 3 %]
30 ’
•
lavare in H2O distillata
5’
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %]
a caldo e filtrato] )
2-3’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine
acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di
fondo rosa tenue
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PAS (acido periodico di Schiff) e PAS
Diastasi”
•
sezioni in H2O distillata
•
alcune
sezioni
possono
essere pre-trattate
con amilasi (diastasi) [0.1 % in
PBS] a 37 °C
30 ’
•
•
contrasto
nucleare
con
emallume
5’
lavare in H2O di fonte
15
’
•
HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1
% in H2O distillata]
15 ’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
lavare in H2O distillata
’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
•
reattivo
di Schiff (fucsina
solforosa)
45 - 60 ’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
lavare in metabisolfito di
sodio [5 %]
2’
•
montare in mezzo d’inclusione
•
•
lavare in H2O di fonte
5
15’
(3 cambi)
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glicoproteine
neutre
rosso
magenta.
Dopo
pretrattamento con diastasi il glicogeno non
si colora
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ALCIAN - PAS (VIALLI)”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare in H2O distillata
10’
•
soluzione Alcian blu 8 GX
•
contrasto
nucleare
ematossilina Carazzi
’
con
5
•
lavare in H2O di fonte
’
15
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
[1% in CH3COOH 3 %]
30 ’
•
lavare in H2O distillata
5’
•
HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1
% in H2O distillata]
15 ’
•
lavare in H2O distillata
’
•
reattivo
di Schiff (fucsina
solforosa)
45 - 60 ’
•
lavare in metabisolfito di
sodio [5 %]
2’
5
Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine
acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e
sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene
rosso; colorazione citoplasmatica di fondo
rosa tenue; altre strutture giallo
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere in alcool isopropilico 60 %
•
soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool
isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata
20’
•
differenziare in alcool isopropilico 60°
20”
•
lavare in H2O di fonte
5’
•
eventuale colorazione nucleare con ematossilina
5’
•
lavare in H2O di fonte
•
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo
rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro
5’
10’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere in alcool etilico 55 °
•
soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 °
40’
•
differenziare in alcool etilico 55°
20”
•
lavare in H2O di fonte
•
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale
metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi
grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i
proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia
ben differenziato dal colore dei lipidi
5’
5’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
immergere in alcool etilico 70 °
5’
soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed
acetone in parti eguali
10’
differenziare in alcool etilico 50°
20”
lavare in H2O di fonte
5’
Emallume acido di Mayer, filtrato,
7’
lavare in H2O di fonte
5’
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio;
nuclei blu - scuro
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere
in
soluzione
contenente Orceina [1 g +
0.4 ml acido nitrico + 100 ml
alcool etilico 95 °]
24 h
•
lavare l’ eccesso di colorante
in alcool etilico 85 °
2’
•
lavare H2O distillata
•
colorare
con
miscela
contenente : [0.35 g Blu di
alizarina acido + solfato di
alluminio 10 g / 100 ml H2O
distillata]
10’
•
lavare H2O distillata
•
soluzione acquosa di acido
fosfomolibdico
[5
% ]
20’
•
lavare H2O distillata
•
soluzione
contenente
:
[Orange G 2 g + verde luce 0.2
g + CH3COOH 2 ml /100 ml
H2O distillata]
10’
•
lavare H2O di fonte
5’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
10’
10’
Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro;
fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre
collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina
arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro
10’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
ossidare in permanganato di
K
(
KMnO4
)
5’
lavare in H2O di fonte
5’
soluzione di acido ossalico
(C2H2O4)
1’
lavare in H2O di fonte
5’
mordenzare in Allume ferrico
[2 %]
5’
lavare in H2O di fonte
5’
lavare in H2O distillata
soluzione di Argento nitrato
(AgNO3) ammoniacale [10 %]
al buio
5 - 8’
lavare in H2O distillata
sviluppare in soluzione di
formalina [10 %]
3’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
lavare in
H2O di fonte
5’
lavare in H2O distillata
differenziare in Cloruro oro
(HAuCl4) [1 %]
8 - 10’
lavare in sodio tiosolfato
(Na2SO2O3) [5 %]
5’
lavare H2O di fonte
5’
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
lavare H2O di fonte
5’
disidratare in etanolo 95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno
scuro; nuclei rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ELASTIC - VAN GIESON”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
ossidare con soluzione di
KMnO4 (permanganato di K)
5’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione di C2H2O4 (acido
ossalico)
1’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione
di
Weigert
(resorcina - fucsina) a 60° C
120’
lavare H2O di fonte
10’
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
3’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
lavare H2O di fonte
10’
soluzione satura Li2CO3 15”
lavare H2O di fonte
10’
soluzione
di Van Gieson
(fucsina acida [1 %] 5 ml +
acido picrico 95 ml)
3’
lavare H2O di fonte
5’
disidratare in etanolo 95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero;
collagene rosa - rosso; connettivo giallo;
nuclei blu scuro
MICROSCOPIA ELETTRONICA
• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza
d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone
elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt)
che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti
elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.
• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di
ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra
fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di
una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti
possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.
• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di
ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie
di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo
il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come
un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente
su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a
100.000 x.
• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le
sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in
Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e
colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato
di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.
MICROSCOPIA ELETTRONICA
“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”
•
•
•
•
•
•
•
•
•
fissare un frammento di 1 mm3 in
glutaraldeide [2.5 %]
in buffer
cacodilato o in PBS a 4 °C
2-6 h
lavare in PBS (3 cambi)
10’
post-fissazione in tetraossido di
osmio [1.30 %] a 4 °C
2h
lavare in PBS
20’
disidratare i campioni in serie
ascendente di alcool
2-3 h
chiarificare in toluene o in ossido di
propilene
1h
resina epossidica EPON + toluene [1 :
1]
RT
12 h
resina epossidica EPON RT
12 h
inclusione in capsule di gelatina o di
plastica e polimerizzazione in stufa a
60 °C
48 h
•
•
•
•
•
•
•
•
taglio delle sezioni ultra-sottili
con ultra-microtomo con lama di
cristallo o di diamante
le
sezioni,
di
spessore
appropriato, vengono raccolte su
dei retini di rame circolari e di 3
mm di Ø
colorare con acetato di uranile in
soluzione acquosa satura
10’
lavare in H2O distillata
colorare con citrato di piombo
10’
lavare in H2O distillata
far seguire la disidratazione
secondo le tecniche usuali
osservare al M.E.
Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e
maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco
e nero e\o con tonalità di grigio.
Citologia
Finalità
Necessità di ottimale fissazione e
colorazione delle varie componenti
Modalità di preparazione
Preparati citologici
• Cervice uterina
• Striscio - Spatole
• Citocentrifugati
• Urine
• Versamenti
• Bronchi
• Spazzolati
• Vie bilari
• Polmone
• Mammella
• Tiroide
• Linfonodi
• Agoaspirati
• Microbiopsie
Citologia
• Automatica
• Strisci
• Analisi d’immagine
• Citometria di flusso
• Ago
• Spatole
• Anse
• Citocentrifuga
• Centrifugazione liquidi
• Inclusione di sedimenti
Filtri Millipore
Agoaspirati
Sedimenti
Fissazione
Principali Fissativi
Inclusione
Alcool
O
Formalina
H- C
H
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“PAPANICOLAOU”
•
sezioni in H2O distillata
•
Ematossilina di Harris,
filtrata,
3’
•
lavare H2O di fonte
5’
•
soluzione alcool - acida a
pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”
•
lavare H2O di fonte
•
Colorare in Orange G 6
3’
•
etanolo 95° (2 cambi)
•
Colorare in EA 50
•
etanolo 95° (2 cambi)
2’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
4’
•
lavare H2O di fonte
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
•
soluzione di etanolo 70°
2’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
•
soluzione di etanolo 95°
2’
10’
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante
tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosaarancione\rosso chiaro (eosinofilia)
20”
3’
20”
Col. Papanicolau
Vantaggi ed eventi determinanti
• -Definizione dei
dettagli nucleari
• -Corretta fissazione
• -Buona col. Nucleare
• -Trasparenza
citoplasmatica
• -Coloranti con sol.
altamente alcooliche
• -Adeguata
diafanizzazione
• -Differenziaione dei
vari tipi cellulari
• -Colorazione
policromatica
Problemi di colorazione con
Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida
-Insufficente rimozione di
“fissativi a pellicola” (polietilenglicole + alcool etilico)
-azione decolorante di HCl
-striscio parzialmente asciugato
prima della fissazione
Problemi di colorazione con
Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida (2)
-pH dell’acqua corrente
poco alcalino
-colorante troppo vecchio
Problemi di colorazione con
Papanicolau
2)Coloraz. Nucleare troppo intensa
-fissazione con alcool >95%
-tempo di immersione in HCl
troppo breve
-striscio troppo spesso
che trattiene il colore
(N.B. è possibile decolorare)
Problemi di colorazione con
Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica
insoddisfacente
-permanenza in alcool 70%
troppo lunga = decolorazione
-asciugatura dello striscio prima
della fissazione = tutto rosa
Problemi di colorazione con
Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica
insoddisfacente
-striscio di alterno spessore
-tempo di coloraz. scarso o non
scuotimento del cestello
-scarsa col. con verde luce =
sostituire o pH non 4,5-5
Problemi di colorazione con
Papanicolau
4) Riscio di inquinamento e
trasporto di cellule
-filtrare i coloranti
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GIEMSA”
•
sezioni in H2O distillata
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
Giemsa puro diluito in H2O
al [10 o 20 %]
60’
•
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
differenziare in CH3COOH
diluito (0.4 ml acido acetico
glaciale \ 100 ml H2O)
10”
•
lavare in H2O distillata
•
differenziare in etanolo 95°,
controllando al microscopio
10”
•
arrestare la differenziazione
con alcool iso-propilico
2’
(3 cambi)
effetto Giemsa : produce una
particolare colorazione viola rossastra della cromatina del
nucleo a causa dell’ eosinato
di Azur.
La soluzione di Giemsa pura
è
formata
da
eosinato
di Azur II, contenente eosinato
di Azur B ed eosinato di
blu di
metilene
sciolti
anaparti.
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile
rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto
* specialmente elettiva per le cellule del sangue *
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GIEMSA modificato”
• sezioni fatte
all’aria
• post-fissazione
metanolo
essiccare
in
15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• soluzione di Giemsa puro
diluito al [15 %] in buffer
fosfato a pH 6.8 (22 ml
0.5 M Na2HPO4 + 32 ml
0.5 M KH2PO4 / 1000 ml
H2O distillata)
15’
• lavare in H2O distillata
(3 cambi)
• fare asciugare a secco
• chiarificare
cambi)
in
xilolo
(3
• montare
in
mezzo
d’inclusione (Entellan
o
balsamo Canada)
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile
rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto
(eseguito specie su strisci)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GRAM”
•
sezioni in H2O distillata
•
cristalvioletto
metile [1 %]
•
scolare eccesso di colorante
•
soluzione di Lugol
•
lavare in H2O di fonte
•
differenziare in soluzione di
alcool - acetone
20”
•
lavare in H2O di fonte
•
fucsina basica
neutro [1 %]
•
lavare in H2O di fonte e
tamponare con carta bibula
o
•
violetto di
1 - 2’
3 0”
o
disidratare in etanolo 100° 1’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
rosso
1 - 2’
Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri
Gram - rosso; colorazione di fondo rosa
N. B. : porre attenzione alla differenziazione
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”
•
sezioni in H2O distillata
•
fucsina basica [10 ml di
soluzione al 10 % in etanolo
100 °] in acido fenico [+100
ml fenolo 5 % in H2O distillata
e filtrato]; flambare le sezioni
sul bunsen sino a farle
fumare
•
lavare in H2O distillata
•
differenziare in soluzione
alcool - acida [HCl 3% in
etanolo 70°] finché le sezioni
non cedono più colore
•
lavare in H2O di fonte
•
blu di metilene [1 % in H2O
distillata]
5 - 10 ’
•
lavare in H2O di fonte
•
disidratare in etanolo 100°
sino a che le sezioni non
divengono blu pallide
2’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
10 ’
Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso;
flora batterica e tessuti vari blu
N. B. : porre attenzione alla differenziazione
INCLUSIONE DELLE CELLULE
Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :
E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il
materiale cellulare sia conservato durante i passaggi
analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina
così da renderle compatte e non dispersibili.
• celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi
in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di
etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)
• riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene,
svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde
ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)
• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la
celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso
• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare
e centrifugare
• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento
nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.
COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA
Ematossilina - Eosina
•
sezioni in H2O distillata
•
Ematossilina di Harris,
•
•
filtrata,
3’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione alcool - acida a
pH 3 (alcool 70° + HCl)
10”
•
lavare H2O di fonte
2’
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
lavare H2O di fonte
•
Eosina [0.25 %], acidificata
con qualche goccia di
CH3COOH
1’
•
lavare in H2O distillata
2’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
10’
Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro;
citoplasma ed emazie rosa-rosso.
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”
•
sezioni in H2O distillata
•
sodio tiosolfato [3 %]
•
ossidare le sezioni in HIO4
[0.5 % in H2O distillata] 15 ’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
’
•
verde di metile [1 %] 5 - 10 ’
•
disidratare in etanolo 95°
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
•
5
mettere le sezioni al buio a
60
°C
nella
soluzione
argentica pre-riscaldata (10
ml di metenammina [3 %] +
0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2
ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
HAuCl4 (cloruro oro) [1 %]
2-3’
2-3’
5 - 10 ’
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ARGENTO - METENAMMINA - PAS”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
soluzione Ammoniaca [2 %]
in etanolo 95°
overnight
ossidare le sezioni in HIO4
[0.5 % in H2O distillata] 15 ’
lavare in H2O distillata
5
’
mettere le sezioni al buio a
60
°C
nella
soluzione
argentica filtrata e preriscaldata : (25 ml H2O
distillata + 2 ml di Borace [5
%] + 25 ml soluzione stock :
(100 ml di metenammina [3
%] + 5 ml di AgNO3 [5 %])
controllare al microscopio
30’ - 40 ’
lavare in H2O distillata
5
’
HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %]
2-3’
lavare in H2O di fonte
5’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 ’
lavare in H2O distillata
5’
liquido di Bouin a 60 °C 30’
lavare in H2O di fonte
10’
lavare in H2O distillata
5’
soluzione
di
acido
Fosfotungstico [2 %]
1 - 2’
lavare in H2O di fonte
10’
soluzione di cromotropo 2 R :
(100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g.
cromotropo 2 R)
15 ’
lavare in H2O distillata
5’
disidratare in etanolo 95° 3 ’
disidratare in etanolo 100° 3 ’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
neutro
Risultati : miceti in nero; membrane basali in
nero; background in rosso
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI MANN - DOMINICI”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione di Lugol
•
decolorare in iposolfito di
sodio [5 %]
2’
5’
•
soluzione di blu di toluidina
[0.5 %]
2 - 3’
•
lavare in H2O di fonte
•
differenziare in CH3COOH
sino a che le sezioni virano
al rosa
3’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
•
disidratare in etanolo 95°
•
soluzione Dominici (Orange
G [1 %] + eritrosina [0.2 %] +
0.05 ml CH3COOH)
10 - 15’
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
5’
5’
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili
rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti
basofili blu
elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed
i midolli
COLORAZIONE IN CITO-GENETICA
“METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g
orceina + 100 ml H2O distillata
•
lavare in CH3COOH [45 %]
•
lavare
in
30’
1’
alcool
butilico
terziario
2’
•
soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora
una variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati
passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la
cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in
verde chiaro.
2’
Microscopia a fluorescenza
Piccole quantità
Fluorescenza
Illuminazione con luce a  breve
Emissione nel visibile
Filtri
Eccitazione / Sbarramento
Fluoroforo
Caratt. Spettro di Assorbimento
(Fluorocromo)
Caratt. Spettro di Emissione
Fosforescenza
Tipi di Fluorescenza
• Autofluorescenza
- fibre elastiche
- NADH2
- Vit. A
- LIPOFUSCINE
- Porfirine
Tetracicline
Adriamicina
- Farmaci
Chinacrine
Benzopirene
O
• Fluorescenza indotta - Amine biogane + C
H
 carboline
N
• Fluorocromi
DNA
- effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici
ACRIDINE ORANGE (verde)
METACROMASIA
A.O.
Citologia
RNA
concentrazione
Rosso
polimeri
1 maggiore
METACROMASIA MASCHERATA
Reagenti di SCHIFF
Fluorescenti
ALDEIDI
FUCSINA BASICA (para-rosanilina)
Tioflarina T
AMILOIDE
PROCION yellow
BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE
cellule
(neuroni)
cell sorting
XENON
MERCURIO
IMMUNOFLUORESCENZA
Lampade
Problemi di DECADENZA
FOTOGRAFIA
Liq. di montaggio
VETRI
Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni
• Importanza in patologia diagnostica
Acidi Nucleici
• Coloraz. con coloranti basici
•M.O. Ordinaria
•M. Fluorescenza
(Acridina Orange)
Metacromasia
• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)
• Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)
• Reaz. Di FEULGEN
Metodi per la dimostrazione
di acidi nucleici
· Metodi qualitativi
quantitativi
· Interesse in patologia
· Distribuzione del DNA
· Met. Feulgen
VIRUS
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
• CROMO-GALLOCIANINA
• Reaz. di FEULGEN
per legame purina - Desossiriboso
Idrolisi acida
Formaz. di gr. aldeidici
Frammentazione del DNA
Concentrazione
HCl
Temperatura
Sensibilità
Specificità di
- reazione
- localizzazione
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“FEULGEN reazione”
•
sezioni in H2O distillata
•
idrolisi in HCl 1 N a 60 °C
per un tempo ottimale in
relazione al fissativo usato
da 4’ a 25’
(usare anche HCl
RT)
•
lavare in HCl 1 N freddo e
poi in H2O distillata
•
reattivo di Schiff
•
lavare
in metabisolfito di
sodio [5 %]
2’
•
verde
40’ - 60’
lavare in H2O di fonte
15’
luce
[1
%]
1’
•
5 N a
(10’)
•
contrasto citoplasmatico con
lavare
in
H2O
di
fonte
2’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in
rosso magenta; citoplasma verde
Metodi per la dimostrazione
di acidi nucleici
· Metodi qualitativi
quantitativi
· Interesse in patologia
· Distribuzione del DNA
· Met. Feulgen
VIRUS
Valutazione quantitativa
Principi
Luce
Cell
Variazione di assorbimento
Lunghezza d’onda
Metodi alternativi
BRDU
TIMIDINA TRIZIATA
- Ibridizzazione in situ
- Immunocitochimica
- Autoradiografia
- Citofluorimetria
cell sorter
Laser
Autoradiografia
• Principi
• Potere di risoluzione
• Stripping
• Emulsione
• Marcatori H3 / P4 / S
Tempo di Esposizione
• Timidina H3
• Principi
• Ibridizzazione in situ
• Legame di affinità
(Conteggio granuli / fondo)
Ibridizzazione in situ (ISH)
• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)
• mRNA specifico - gene espressione
(vantaggi rispetto a ICC)
• RNA / DNA virale
• Metodi - Sonde
Riboprobes Marcatura - Raidoatt.
Oligos
Auto-radiografia
-S
-H
- pH
Non radioatt.
• Biotina
• Digoxiganina
• Fluorescina
ICC
IBRIDIZZAZIONE IN SITU
ISH
• Questa
tecnica
consente di
identificare
specifiche
sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule
tali sequenze sono espresse.
• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del
DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta
ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi
ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari
[IBRIDIZZAZIONE].
• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere
visibile
l’ avvenuta
ibridizzazione di
doppie eliche
neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso
complementari.
• La
marcatura
del DNA avviene
chimicamente
per
inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della
Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi
con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la
fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).
• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di
positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi
evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.
Ibridizzazione in situ (ISH)
• Sensibilità
• Problemi
• Localizzazione (Definizione)
• Conservazione strutturale
• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni
• Sistemi laser / catapulta
(necessità di identificazione del tipo di cellule)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”
•
sezioni in H2O distillata
•
sodio tiosolfato [3 %]
•
trattare in soluzione di Lugol
10’
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
lavare in H2O distillata
•
•
mettere le sezioni al buio a
60
°C
nella
soluzione
argentica pre-riscaldata (10
ml di metenammina [3 %] +
0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2
ml
di
Borace [5 %])
60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
•
disidratare in etanolo 95°
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
5’
2-3’
4’
(3 cambi)
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
HAuCl4 (cloruro oro) [1 %]
2-3’
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : granuli di melanina nero; cheratina
arancio; nuclei rosso intenso
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PERLS x IL FERRO”
•
sezioni in H2O distillata
•
5’
•
lavare H2O di fonte
soluzione di
di K [10 %]
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
soluzione di Ferrocianuro K
[10 %] + HCl [10 %] (70 ml
+ 30 ml)
25’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
Ferrocianuro
5’
•
•
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %]
a caldo e filtrato] )
2-3’
5’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : i depositi di ferro si colorano in
blu; i nuclei in rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici
(pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PER IL RAME”
•
sezioni in H2O distillata
•
•
soluzione
di
lavoro
di
Rhodanina [0.3 % in etanolo
100°] (6 ml / 100 ml H2O
distillata) a 60° C
120 180’
lavare
in
soluzione
di
Borace [0.5 %] (tetraborato di
sodio)
2’
•
lavare H2O distillata
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
•
•
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
contrasto
nucleare
ematossilina Carrazzi
•
lavare H2O distillata
5’
con
1’
Risultati : depositi di rame color rosa - rosso;
nuclei blu scuro
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione acquosa di AgNO3
(nitrato Argento) [3 %]
60’
•
sviluppare in una soluzione
di idrochinone [0.5 %]
3’
•
lavare H2O di fonte
•
•
•
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
•
lavare H2O di fonte
5’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
fissare in una soluzione di
tiosolfato di sodio [5 %] 3’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
5’
5’
Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati)
nero; nuclei rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici
(pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“DI FOUCHET x LA BILE”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare H2O distillata
•
soluzione
di
lavoro
secondo
Fouchet : (acido Tricloroacetico
(C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro
ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml)
5 - 10 ’
•
disidratare in etanolo 95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione (Entellan
•
•
lavare H2O distillata
soluzione
di Van Gieson (fucsina
acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95
ml)
3’
o balsamo Canada)
Risultati : biliverdina color verde; collagene
rosa - rosso; connettivo giallo
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“LUXOL FAST BLUE”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione di Luxol Fast
Blue 2 G [0.1 % in alcool
isopropilico]
60’
•
disidratare
in
alcool
isopropilico assoluto
5’
(3 cambi)
•
chiarificare
cambi)
•
montare
in
mezzo
d’inclusione (Entellan
o
balsamo Canada)
in
xilolo
(3
Tale
colorazione, sebbene
poco specifica
per
i
fosfolipidi, li colora in modo
soddisfacente, specie
se
disciolti
in
alcool
isopropilico e quindi fornisce
ottima
colorazione
della
mielina
integra (costituita
dalla
membrana
cellulare
della cellula di Schwann).
Risultati : la mielina appare in blu
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :
“CLORO - ACETATO ESTERASI”
•
•
•
•
•
•
PREPARAZIONE SOLUZIONI
sol. A : Naftolo AS-D
Cloroacetato [10 mg.] +
Dimetilformamide [1 ml.]
sol . B : buffer fosfato0.1 M
[30 ml.]
sol. C : Pararosanilina - HCl :
Pararosanilina idrocloride [2
g.] + HCl 2n [50 ml]
(sciogliere
a
caldo,
raffreddare e filtrare)
sol. D : Sodio Nitrato [400
mg.] + H2O distillata [10 ml.]
sol. E :
“working”
Pararosanilina - HCl : sol. C
[0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
soluzione substrato : ( 0.8 ml.
sol. E + 30 ml. sol. B;
sistemare il pH a 6.3 e
aggiungere la sol.
A;
mescolare e f iltrare)
1’ - 2’
lavare con H2O distillata
5’
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
5’
lavare H2O di fonte
10’
soluzione satura Li2CO3 15”
lavare H2O di fonte
10’
disidratare in etanolo 95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in resina sintetica
Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in
rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro
SICUREZZA IN LABORATORIO
• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE
POTENZIALMENTE INFETTO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
BIOLOGICO
COME
SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI
USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE
USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE
AZOTO LIQUIDO
USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO
USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER
FORMALDEIDE E PER XILENE
USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE
USARE
MASSIMA
CAUTELA
NELL’ IMPIEGO DI
ULTRACENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED
APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE
EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E
TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE
CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I
SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA
OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI
NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN
LABORATORIO
RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO
•
RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER
AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA
LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.
•
RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm)
e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI
ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....);
ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti :
ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......);
ESPOSIZIONE
VERSO
LA
DAB (benzidina derivato);
ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in
M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL
LATTICE.
•
RISCHIO
NUCLEARE
:
ESPOSIZIONE
VERSO
ISOTOPI
3
14
45
RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES ( H, C, Ca, 32P,
90Sr, 35S, 131I).
•
RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI
CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala
anatomica); ESPLOSIONI
ED
INCENDI
ACCIDENTALI (nella
preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI
DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.
ARTEFATTI ISTOLOGICI
Definizione
Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo
naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di
materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione,
inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini.
E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di
interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o
una malattia del paziente.
ARTEFATTI ISTOLOGICI
1)Artefatti causati prima del prelievo:
1.1. Polvere di talco
1.2. Materiale di sutura
1.3. Effetto da termocauterio
1.4. Effetto da agenti chimici
1.5. Particelle di carbone
6. Garza
1.7. Essicamento
ARTEFATTI ISTOLOGICI
2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il
trattamento istologico
2.1. Effetti di schiacciamento
2.2. Essiccazione
2.3. Congelamento
2.4. Chinatura
2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere
ARTEFATTI ISTOLOGICI
3) Artefatti durante la fissazione
3.1. Autolisi durante la fissazione
3.2. Fissazione inadeguata o incompleta
3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker
(coartazione)
3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico
3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina
3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina
ARTEFATTI ISTOLOGICI
4)Artefatti legati a procedure di inclusione
4.1. Inadeguata fissazione
4.2. Inadeguata disidratazione
4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti
4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina
4.5. Uso di paraffina troppo calda
ARTEFATTI ISTOLOGICI
5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione
5.1. Inclusione di frammenti multipli di
diversa durezza
5.2. Orientamento scorretto dei frammenti
5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta
ARTEFATTI ISTOLOGICI
6)Artefatti da sezionamento erroneo
6.1. Angolo di taglio sbagliato
6.2. Lama o blocchetto mal fissati
(effetto “tende alla veneziana”)
6.3. Lame poco affilate
6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo
“pesci”
ARTEFATTI ISTOLOGICI
7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini
7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini
7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo
7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti
7.4. Pieghe nelle sezioni
7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni
7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione I
8.1. Mancata sparaffinatura
8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro
8.3. Sbagli nella colorazione con:
8.4. Ematossilina di Harris
8.5. Emallume di Mayer
8.6. Eosina
8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione II
Sbagli nelle colorazioni speciali:
8.5. PAS
8.6. PAS-diastasi
8.7. Rosso Congo
8.8. Giemsa
8.9. Feulgen
8.10. Metenamina-argento per i funghi
ARTEFATTI ISTOLOGICI
9) Errori nel montaggio con coprioggetto
9.1. Contaminazione del liquido di montaggio
9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
9.3. Erroneo posizionamento del vetrino
9.4. Intrappolamento di bolle d’aria
9.5. Montante troppo abbondante
9.6. Montante troppo scarso
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.1.) Errori nella raccolta delle cellule
c.1.1. Cellule sovrapposte
c.1.2. Cellule troppo rade
c.1.3. Eccessiva quantità di sangue
c.1.4. Mancato uso di adesivo
c.1.5. Effetto da citocentrifuga
c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)
c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.2.) Errori nella fissazione delle cellule
c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione
(nella col. di Papanicolau)
c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento
(nella col. di Giemsa)
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.3) Errori nella colorazione delle cellule
con la col. di Papanicolau
c.3.1. Col. Nucleare troppo debole
c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa
c.3.3. Col. con Orange G troppo debole
c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa
c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole
c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto
c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio
c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino
c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria
c.4.5. Montante troppo abbondante
c.4.6. Montante troppo scarso