Bioinformatica
Pictar – miRanda - TargetScan – miRiam
Dr. Giuseppe Pigola – [email protected]
Predizione di Target

I microRNA sono delle piccole molecole di RNA (circa 21-23 nucleotidi);

La loro importanza è dovuta al fatto che essi sono coinvolti nella regolazione
dell’espressione genica;

Sono coinvolti in diversi processi, funzioni e malattie;

Presentano una complementarità parziale (quasi sempre) o totale (più raramente)
delle loro basi rispetto a quelle dei loro mRNA bersaglio;

I miRNA sono in grado di impedire la traduzione dei loro target preservandone la
stabilità o provocandone la distruzione;

Un miRNA può avere più target ed uno stesso mRNA può essere target di diversi
miRNA.
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Bioinformatica
Predizione di Target

Sebbene si conoscano circa 1000 miRNA nell’uomo (e molti altri in altre specie),
solo per una piccola parte di essi è stato individuato almeno un target;

Esistono numerosi tool su web che offrono servizi di predizione di target per
miRNA:
 TargetScan, PicTar, miRanda,……;

Permettono ai ricercatori di limitare la lista di potenziali geni targets per la
conferma sperimentale;

Molti di essi offrono dei database di predizioni già effettuate da consultare;

Predizioni basate unicamente sulle regole d'accoppiamento tra basi producono un
grande numero di risultati falsi positivi.
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Bioinformatica
PicTar -
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http://pictar.mdc-berlin.de/
Bioinformatica
PicTar -
http://pictar.mdc-berlin.de/

Prima cerca siti di legame di 7 nucleotidi nella fine della regione 5' iniziando
dalla prima o dalla seconda posizione;

L'energia libera del legame tra microRNA e target e successivamente calcolata
per seed con match imperfetti;

Per delineare una lista di siti target predetti, vengono impostate alcune soglie
d'energia e successivamente viene calcolato un punteggio di massima
verosimiglianza in base alla conservazione attraverso molteplici organismi.
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Bioinformatica
PicTar -
http://pictar.mdc-berlin.de/
Ricerca per target di un miRNA

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Bioinformatica
PicTar -
http://pictar.mdc-berlin.de/
Ricerca per target di tutti i miRNA (inserendo un gene target)

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Bioinformatica
PicTar -
http://pictar.mdc-berlin.de/
Ricerca per tessuto (bisogna scegliere il DB adatto)

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Bioinformatica
PicTar -
http://pictar.mdc-berlin.de/

ESERCIZIO

Ricercare tutti i miRNA che hanno per target bcl2.

Elencare almeno tre miRNA.

Per il miRNA hsa-miR-182 quanti sono i possibili target su BCL2 in Homo
Sapiens?

Quale è la sequenza del primo target?
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miRanda -
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http://www.microrna.org
Bioinformatica
miRanda 
http://www.microrna.org
I concetti base dell’algoritmo di miRanda sono:
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
Appaiamento
delle
sequenze
miRNA/Target (Algoritmo di SmithWaterman). Soltanto gli allineamenti che
superano un certo threshold passano alla
fase successiva;

Valutazione termodinamica dei duplex
predetti (Viene calcolata l’energia libera
della struttura secondaria). Minore è
l’energia libera, più stabile il legame;

Analisi della conservazione dei siti di
legame in specie diverse;
Bioinformatica
miRanda 
http://www.microrna.org/microrna/home.do
E’ possibile accedere alle predizioni effettuate per uomo, topo e ratto.
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Bioinformatica
miRanda -
http://www.microrna.org/microrna/home.do

E’ possibile effettuare la ricerca per miRNA (Es. miR-15a):

E’ possibile effettuare la ricerca per target (Es. Bcl-2):
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miRanda -
http://www.microrna.org/microrna/home.do

Cerchiamo i target predetti per il miRNA miR-15a in Homo sapiens:

Cliccando su “view targets” si ottiene l’elenco dei target, con i dettagli degli
appaiamenti:
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Bioinformatica
miRanda 
http://www.microrna.org/microrna/home.do
Cerchiamo i miRNA per i quali il gene Bcl-2 è un target predetto:
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Bioinformatica
miRanda -
http://www.microrna.org/microrna/home.do

ESERCIZIO

Ricercare tutti i miRNA che hanno per target SOD2 in Homo Sapiens.

Quanti miRNA trovate?

Visualizzare le sequenze dei target.
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Bioinformatica
TargetScan -
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http://www.targetscan.org/
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TargetScan 
http://www.targetscan.org/
TargetScan elabora i binding sites basandosi sulla complementarietà
perfetta di una regione a 7 nucleotidi conservata attraverso cinque
organismi tra le basi 2-8 della regione 5' alla fine del microRNA;
Conservati in molti vertebrati
Conservati nella maggior parte
dei mammiferi
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TargetScan -
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http://www.targetscan.org/
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TargetScan 
http://www.targetscan.org/
Table of miRNA sites:
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Bioinformatica
TargetScan -
http://www.targetscan.org/

Tipi di binding site:

8mer: Un match esatto nelle posizioni da 2 a 8 del miRNA maturo (il seed +
posizione 8) seguito da una 'A‘;

7mer-m8: Un match esatto nelle posizioni da 2 a 8 del miRNA maturo (il seed
+ posizione 8);

7mer-1A: Un match esatto nelle posizioni da 2 a 7 del miRNA maturo (il
seed) seguito da una ‘A’;
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Bioinformatica
TargetScan -
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http://www.targetscan.org/
Bioinformatica
TargetScan -
http://www.targetscan.org/

ESERCIZIO

Ricercare tutti i miRNA che hanno per target bax settando come organismo il
topo.

Ci sono miRNA che interagicono con il gene?

Ci sono miRNA ampiamente conservati nei vertebrati? Di che tipo di legame si
tatta?

Ci sono miRNA conservati tra la maggior parte dei mammiferi? Di che tipo di
legame si tatta?

Ci sono miRNA scarsamente conservati? Di che tipo di legame si tatta?
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Bioinformatica
miRiam -
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http://ferrolab.dmi.unict.it/miriam.html
Bioinformatica
miRiam -
http://ferrolab.dmi.unict.it/miriam.html

Basato su caratteristiche termodinamiche;

Vincoli empirici;

Sfrutta l’accessibilità della struttura secondaria del mRNA dedotta da
interazioni miRNA/mRNA conosciute;

miRiam è fornito come programma standalone (in python);

./miriam source=hsa target=bcl2.fasta *

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Ricerca potenziali binding site su bcl2 per miRNA di Homo Sapiens
Bioinformatica
miRiam -
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http://ferrolab.dmi.unict.it/miriam.html
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Altri Tool

PITA incorpora la funzionalità dell'accessibilità al sito di target, determinata dalle interazioni
d'appaiamento di basi all'interno dell'RNA messaggero, nella ricognizione di target di
microRNA;

RNA22 trova siti di legami di microRNA nella sequenza d'interessa, e successivamente
identifica il target;

RNAhybrid trova l'energia minima dell'ibridizzazione di RNA lunghi e corti;


MicroTar valuta la complementarieta di target di microRNA e i dati termodinamici;
DIANAmicroT è una variante di miRanda, usa alcune regole iniziali modificate per
l'accoppiamento di basi che si focalizzano sulle dimensioni di possibili rigonfiamenti iniziali;
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Altri Tool

miTarget

basato su un classificatore Support Vector Machine (SVM);

Prende in considerazione l'energia libera termodinamica di ripiegatura tra il microRNA ed
il possibile sito di target;

Complementarietà di basi in specifiche posizioni;

Mancano targets validati sperimentalmente;
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