Lezione 21 - 22
mercoledì 4 maggio 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
Approccio olistico globale allo
studio della biologia
Sviluppo del metodo riduzionistico incapace
di sviluppare lo studio delle interazioni
multiple tra le funzioni cellulari
nuove tecniche nuovi vettori
Dall’inizio dei progetti di sequenziamento dei Genomi di organismi
eucariotici e’ iniziato un nuovo tipo di approccio per lo studio delle
funzioni ed interazioni dei geni.
Abbiamo visto nel modello murino
- la possibilità di studio di funzione dei geni durante lo sviluppo con il
metodo di knock-out con la ricombinazione omologa.
- la possibilita’ di studiare le interazioni a livello di famiglie di geni.
-i nuovi metodi per lo studio di interazioni tra proteine con geni
reporter e geni regolatori della trascrizione.
- metodi per individuare proteine che legano altre proteine col metodo
del doppio ibrido (variante della complementazione con un gene
reporter)
Sistemi multifattoriali
E’ sempre più necessario poter studiare la funzione di gruppi di geni
per le molte funzioni ed interazioni che esistono, per cui ogni gene può
intervenire in molte funzioni indipendenti ed il cnock-out di un singolo
gene può provocare una cascata di eventi, quello che poteva essere
definito come l’assenza di un unico fenotipo.
In patologia una sindrome è data da un insieme di sintomi che possono
essere appunto spiegati con le molte interazioni ed i molti effetti che
può provocare la disregolazione di un gene.
Andate a rivedere cosa sono gli effetti di EPISTASI E PLEIOTROPIA
Nuove esigenze e nuovi vettori
Sempre più è necessario sviluppare vettori capaci di
integrarsi nei genomi per intervenire sulla espressione e
regolazione dei geni
Prima fase : vettori di espressione
Seconda fase : integrazione sito specifica
Terza fase : ricerca genomica dei geni ignoti,
associazioni con le patologie e SNPs
Quarta fase : ricerca genomica delle regioni regolative e
strutture secondarie regolative
Nuovi vettori per ricombinazione
Ricerca di geni nuovi tramite mRNA di fusione
Quindi sono stati sviluppati due approcci nuovi per la ricerca di nuovi
fenotipi ed espressione di molti geni :
la conoscenza delle sequenze di molti geni coinvolti nel controllo di
funzioni complesse come quelle che regolano la divisione cellulare, la
morte cellulare e le corrispondenti vie di trasduzione dei segnali con le
regolazioni fini ed i processi di stimolazione o inibizione hanno aperto la
necessità di studiare molti geni coinvolti e la variazione di espressione.
Un metodo per cercare geni nuovi in vivo non era stato ancora inventato
L’approccio completamente nuovo e’ stato quello del “gene trapping”
(l’acchiappa geni) per poter individuare molti geni contemporaneamente.
Per poter studiare contemporaneamente l’espressione di molti geni è
stato inventato il metodo dei macro e micro arrays.
Gene trapping “l’acchiappa geni”
Idea luminosa sempre per fare topi transgenici:
Creare un vettore per integrazione random che possa
esprimere la resistenza solo se genera un mRNA di fusione
Premessa: non è detto che dalla conoscenza della intera
sequenza genomica si possa dedurre in maniera completa
quali siano tutti i geni attivi e anche tutti gli eventuali splicing
alternativi a carico dei geni ed in tutti i tessuti
Come deve essere fatto un vettore del genere?
Ricerca dei networks cellulari
Tutte queste tecniche sono state sviluppate a partire dall’idea di vedere in maniera
olistica, cioe’ con un approccio globale come i geni interagivano nel complicato
network cellulare.
Le interazioni cellulari ed intercellulari hanno la possibilita’ di essere studiate non
piu’ con un approccio semplice di inerazione un gene una proteina ed una funzione,
ma molti geni con le loro interazioni mediate dagli enzimi a tutti i livelli a partire
dalla trascrizione, dalle interazioni a livello nucleare, citoplasmatico di membrana, di
trasporto e di secrezione e quindi le interazione con altre cellule.
I macro e poi micro-arrays mettono a disposizione su supporti di vario tipo centinaia
di geni selezionati e a volte in toto per vederne l’espressione.
Nel caso di patologie in cui non sono ancora conosciute le cause dell’attivita’
degenerativa di geni coinvolti, si possono vedere le differenze tra l’espressione dei
geni in condizioni normali e patologiche e quindi i geni che sono attivati o spenti per
il cattivo funzionamento del gene/geni scatenanti la patologia.
Non solo ricerca di nuovi geni
Per esempio nel caso delle neoplasie i fattori coinvolti partecipano al
controllo della vita cellulare nei vari punti di vitali/essenziali del
controllo delle attivita’ cellulari.
L’approccio globale puo’ far vedere i geni a monte ed a valle coinvolti
ed il punto di mancato funzionamento all’interno della complessa
macchina.
Nel sistema immunitario in cui si conoscono decine di fattori come le
interleukine / chemochine con i rispettivi recettori cellulari si possono
vedere a livello di patologie le reti interattive che ancora non erano state
descritte.
La possibilita’ di vedere la funzione di nuovi geni che ancora non sono
stati descritti per la precisa attivita’ può essere data dalla conoscenza a
livello di genoma della struttura a cui adesso si puo’ attribuire una
funzione generalmente per omologia con altre strutture note.
Geni nuovi e interazioni nuove
Col gene trapping non solo si vogliono individuare geni nuovi,
ma anche le condizioni in cui si attivano ed i fenotipi che
provocano con il KO del gene.
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608-611: Disruption
and sequence identification of 2,000 genes in mouse embrionic stem cells (ES). Brian P.
Zambrowicz et al.
Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con vettori per
geni reporter o selezionabili.
-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivamente clonabili,
-espressione solo se l’inserzione avviene in introni; mi permette di individuare esoni o
promotori di geni attivi e non restringendo/selezionando il tipo di geni marcabili
-finqui’ non esisteva automazione per l’identificazione dei geni bersaglio che possono
non essere trascritti e se ne può individuare anche la regione 5’non tradotta,
Per ottenere questi obbiettivi sono stati sviluppati due nuovi vettori per GeneTrapping:
VICTR3 e VICTR20
Zambrowicz BP, Friedrich GA, Buxton EC, Lilleberg SL, Person C, Sands AT.
Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embryonic
stem cells. Nature. 1998 Apr 9;392(6676):608-11.
The dramatic increase in sequence information in the form of expressed
sequence tags (ESTs) and genomic sequence has created a 'gene
function gap' with the identification of new genes far outpacing the rate at
which their function can be identified. The ability to create mutations in
embryonic stem (ES) cells on a large scale by tagged random
mutagenesis provides a powerful approach for determining gene function
in a mammalian system; this approach is well established in lower
organisms. Here we describe a high-throughput mutagenesis method
based on gene trapping that allows the automated identification of
sequence tags from the mutated genes. This method traps and mutates
genes regardless of their expression status in ES cells. To facilitate the
study of gene function on a large scale, we are using these techniques to
create a library of ES cells called Omnibank, from which sequence-tagged
mutations in 2,000 genes are described.
Gene trapping = metodo basato
sull’uso di cellule staminali
Le cellule embrionali staminali totipotenti di
topo dal momento in cui sono state coltivabili
sono state usate per ottenere topi transgenici
La prima utilizzazione è stata quella della ricombinazione
omologa con cnock-out di un gene.
Il “genetrapping” è un nuovo metodo che permette il cnock-out di
geni che si esprimimono o no in “embrional stem cells” ES
utilizzate per ottenere topi transgenici.
VICTR3 VICTR20
Quali sono i costituenti di questi vettori:
2 componenti : a) acquisizione di sequenza con il promotore della
PGK (fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES, fuso alla
Puromicina N-acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice
donor)
b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter
(colorimetrico) con sito polyA (SAgeobpA o SAIRESgeobpA gene di
fusione 
neomicina)
Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere
marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA
di fusione e ricerca in banca dati del gene.
Controllo HPRT
Esperimento di controllo sulla funzionalità di questo tipo di vettori
-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD (fosfoglicero Kin.,
puromicina, splice donor site) per cercare un gene target per
eccellenza: il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina
fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell’ introne II. (I
geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita’ al terreno
HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt produce
resistenza alla 6-thioguanina).
Le sequenze della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato
l’integrazione nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica
del costrutto.
L’integrazione del vettore al 3’ del gene HPRT produce cellule
sensibili al terreno HAT e resistenza alla 6-thioguanina dando il gene
di fusione con il 3’ ed utilizzando il sito poly A+ del gene endogeno
HPRT.
Gene trapping tramite Victr 3 e 20
vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per
l’integrazione nel genoma ospite)
LTR
VICTR3
VICTR20
LTR
PGK
SA IRES geo
puro
pA
SD
PGK
LTR
puro
SD LTR
Wild-type locus
SA IRES geo pA
AAAAAn
PGK
G
LTR
puro SD LTR
AAAAAn
G
Mappa del vettore VICTR20
ricombinazione nel gene Hprt
clonato nel vettore pRIV6.9I nel sito EcoRI
HindIII
LTR
targeting vector
LTR
probe
WT HPRT
2
H
3
H4
7.1 kb
targetet allele
2
Southern blot Hind digest
LTR
H
LTR 3
9.2 kb
H 4
Controllo su HPRT
Mutazioni su HPRT: il controllo di riferimento in biologia cellulare che crea resistenza.
Studi preliminari hanno mostrato che vettori con il modulo SAbgeobpA sono in grado
di creare alleli “nulli” inattivando i messaggi endogeni.
In questo esperimento sono stati provati VICTR20 e PGKpuroSD per mutagenizzare il
gene HPRT selezionando per la 6-thioguanina resist.
Il vettore PGKpuroSD non ha dato colonie resistenti (controllo con Southern)
Nuovo esperimento di controllo con elettroporazione del plasmide PGKpuroSD o
infettando le cellule staminali ES con il retrovirus prodotto con la linea cellulare
ricombinante di MoMLV per impacchettare VICTR3 e VICTR20.
- trasduzione - selezioni di cloni puromicina +
- isolamneto dell’ RNA e 3’RACE - sequenziamento 80-700 bp dal 75% dei cloni
analizzati manualmente e 60% dall’analisi (automatizzata) robotica
- creazione della banca dati con questi cloni = Omnibank seq. tags OST
-confronto con la GeneBank (versione 100) e SwissProt (vers.34) con Blast
RISULTATI = P<10-30; 18% geni noti; 10% ESTs umani e roditori; 10% ripetiz. B1,
B2 e trasposoni; 61% sequenze sconosciute
Banca dati OSTs
individuare il gene raggiunto ed il sito di integrazione del retrovirus
- analisi Southern per individuare l’inserzione nel gene tirosin-kinasi di Bruton (btk
locus) la sequenza cominciava con l’esone 2 indicando l’inserzione del vettore nel 1
introne di btk.
- analisi con 3 enzimi di restrizione ha confermato questa ipotesi (fig 3)
Controllo dei siti di integrazione
- confronto della seq. cDNA dei cloni OSTs con 108 geni noti: 44% inseriti nelle 350
basi al 5’ dei geni; 12% al 3’ di cDNA codificanti. Benche’ il vettore potrebbe favorire
regioni 5’ ma integra ovunque.
Il vettore dovrebbe integrare in tutti i geni e non solo in quelli espressi in cellule ES,
infatti il gene btk si esprime nei linfociti B. Per RT-PCR si trova in cellule della milza,
ma non in cellule ES.
- sequenziamento di 3000 OSTs ha dimostrato che solo il 10% contiene il vettore dopo
il sito SD esogeno. 61% degli OSTs sta in geni trascritti.
- analisi di espressione per RT-PCR di 37 OSTs (17 elettropor. 20 infez.)
34 sono espressi in cervello, testicoli, ES o embrione 10.5 g
Costrutti
VICTR3 VICTR20
2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK
(fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina Nacetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)
- b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter
(colorimetrico) con sito polyA (SAgeobpA o SAIRESgeobpA)
Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere
marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di
fusione e ricerca in banca dati del gene.
-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della
Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per
ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi
mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin
and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza
della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione
nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.
Race per gene trapping
gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno
geni attivi e non attivi.
Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare
RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver
individuato la regione.
Cloni banca dati OSTs
Ulteriore dimostrazione che i cloni OSTs corrispondono a sequenze esoniche e non a
RNA nucleari non maturi sono stati fatti i Northern di poly A+ RNA di molti tessuti e
ibridati con 16 probes OSTs sconosciuti dando 14 segnali positivi confermando la
presenza di questi geni.
Siccome i prodotti di 3’ RACE tendono ad essere piu’ lunghi degli OST iniziali, e’
stato fatto il sequenziamento aggiuntivo di 290 OSTs con 70-700 bp in aggiunta per
media di 263 bp.
- la nuova analisi Blast sulla GenBank mostra 27% di geni noti (43 noti e 34 ESTs)
questo rinforza il fatto che i vettori si inseriscono in sequenze trascritte. Le sequenze
OST hanno media di 500bp con 74% geni ignoti
Un limite di questo metodo come della selezione di cloni EST e’ la
sottorappresentazione dei geni poco espressi o transienti in tessuti limitati.
Comunque i metodi di “gene trap” non sono senza pressioni selettive per il disegno,
veicolazione, grandezza del bersaglio e accessibilita’ del gene, però i risultati
dimostrano un largo spettro di eventi indipendenti.
Adesso si può sapere la sequenza di ingresso del vettore ed il gene mutato da cui
ottenere il topo transgenico.
costrutti per gene trapping
PT1  geo lacz neo
ei
 geo
ee
pA
ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon
geo = lac z - neo fusion
pA poly adenilation signal
U3  geo
U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk
Sup 5 E. coli sup F tRNA
 geo
U3
 geo
RU5
Sup 5
U3
RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer
TS4
sa
Lac Z
P-neo
RU5
Topi transgenici di III e IV
generazione
I- iniezione DNA blastocisti
II- embrional staminal cells e ricomb. omologa
III- mutanti condizionali Cre-Lox e promot.
tessuto specif. e inducibili
IV- costrutti con cromosomi artificiali BAC,
embrioni tertraploidi
V- gene trapping libraries of ES cells
combinazioni di vettori BAC floxed knock-in
Race per gene trapping
gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno
geni attivi e non attivi.
Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare
RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver
individuato la regione.
A cosa serve la regione in più di VICTR20?
Per trovare la tessuto specificità, perché l’mRNA di fusione sarà
presente solo solo se il gene è trascritto a partire dal promotore
endogeno, mentre la parte al 3’ del vettore è comunque
trascritta per il promotore PGK costitutivo
Topi transgenici che esprimono Cre
Controllo dell’espressione di Cre tramite
promotore tessuto specifico
Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6)
il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum)
Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) gal si colora in
blu perché libera l’espressione eliminando un gene floxed interposto tra
il promotore e LacZ.
• http://authors.elsevier.com.
http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi