Sviluppo di tecnologie innovative per lo studio dei rapporti strutturafunzione dei recettori accoppiati a G proteine e sviluppo di sistemi
“medium-high throughput” per l’individuazione di nuovi farmaci
La fotoproteina EQUORINA
Scopo del progetto
Misura diretta del segnale calcio
Vantaggi:
Il rapporto segnale/rumore è molto alto
Il sistema di rilevamento è semplice e adatto per l’automazione
Le sonde sono indirizzabili in specifiche regioni subcellulari
Utilizzo della fotoproteina equorina,
derivante dalla medusa Aequorea Victoria,
per la generazione di
BIOSENSORI CELLULARI
in grado di rilevare importanti
PARAMETRI CELLULARI
bersagli dei farmaci
Applicazioni:
1- Saggi di traslocazione di proteine dal citosol in membrana
Nella regione subplasmalemmale della membrana cellulare la [Ca2+] è almeno 10 volte maggiore rispetto al resto del citoplasma.
Quindi la traslocazione di una proteina alla membrana dal citosol può essere rilevata fondendo la fotoproteina calcio-sensibile equorina alla proteina di interesse.
PMA
CTR
CTR
PMA
WB: ab anti PKCß
PMA
Cyt
M
CTR
M Cyt
PKCß iperespressa
PKCß endogena
Immunofluorescenza sonda pKC ß-AEQ
Il saggio è stato messo a punto con le pKC (protein chinasi C), importanti target farmaceutici che traslocano
alla membrana dopo stimolazione, coinvolti nel diabete.
Come mostrato nelle figure sopra riportate, la traslocazione in membrana della proteina dopo trattamento con PMA
è stata verificata mediante Western blot e immunofluorescenza.
2-Test di tossicità cellulare
1-alterazioni della risposta calcio mitocondriale
Razionale: l’alterazione del segnale calcio mitocondriale è un
segnale precoce di tossicità e di morte cellulare.
Questo segnale viene monitorato mediante la sonda mt-AEQ,
ovvero una equorina indirizzata al mitocondrio
Sonda mt-AEQ
2-sviluppo di un saggio sensibile per la secrezione di ATP
Razionale: l’ATP e’ un messaggero extracellulare coinvolto in numerose
risposte cellulari come chemiotassi, rilascio di citochine e neuotrasmettitori,
apoptosi e proliferazione cellulare.
La sonda pmeLUC, una luciferasi legata alla membrana cellulare, è un valido
strumento per sondare l’ambiente pericellulare e misurare la concentrazione
extracellulare di ATP.
Sonda pmeLUC
3-Curve dose-risposta di farmaci agonisti e antagonisti di recettori GPCR accoppiati a Gq
agonista
Dose-risposta del consumo di equorina (destra) e
segnale della chemiluminescenza dei singoli pozzetti
in una piastra da 24 (sinistra)
antagonista
Mediante la sonda mt-AEQ è possibile monitorare
l’attivazione o inibizione di recettori GPCR che
comportano variazioni nella [Ca2+]mitocondriale e
correlare l’emissione di luminescenza della sonda alla
dose del farmaco.
Nel grafico viene illustrata la risposta dose- dipendente
in seguito ad attivazione del recettore P2Y per l’ATP.
Dose-risposta dell’inibizione del consumo di equorina in
presenza di un antagonista recettoriale (destra) e segnale
della chemiluminescenza dei singoli pozzetti in una piastra
da 24 (sinistra)