Colture cellulari
Sistemi di Crescita
ADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o
mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi)
Fenomeno che richiede l’interazione
di recettori di membrana con proteine
adesive, adsorbite sulla superficie della
piastra di coltura
SOSPENSIONE: cellule di
origine ematopoietica (che
normalmente vivono in un
mezzo fluido)
Suspension cultures
Adherent cultures
a. Mechanical
b. Proteolytic enzymes: tripsina,
collagnasi, tripsina-EDTA
c. EDTA
Colture di cellule aderenti
Le cellule aderenti crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile: a questo stadio si
dicono confluenti: la crescita si arresta e le cellule devono essere staccate e trasferite in nuove
piastre.
1. Per il trasferimento si ricorre all’uso di EDTA (chela Ca2+ e Mg2+, indispensabili per l’adesione)
e/o di tripsina (degrada le proteine della matrice);
2. Avvenuto il distacco l’azione dell’EDTA e della tripsina viene neutralizzata dall’aggiunta di nuovo
mezzo di coltura che contiene cationi bivalenti in eccesso ed inibitori della tripsina.
3.Le cellule vengono quindi contate e seminate in nuove piastre, oppure si procede per diluizione.
Il tempo necessario alle cellule per duplicarsi è di circa 20-24 ore a seconda del tipo cellulare.
Terreni per colture
La crescita delle cellule in vitro viene assicurata dalla presenza di elementi
nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, sali minerali) e fattori di
crescita (presenti nel siero)
I terreni usati per le colture cellulari (IMEM; DMEM; RPMI, …) differiscono
tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali, e per la concentrazione di
glucosio. La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno
adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta
produttrice.
Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra
7.2 e 7.4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad
incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 e terreni
contenenti NaHCO3.
Plastica per coltura
Sono generalmente in polistirene:
materiale rigido con superficie lucida
buona resistenza chimica a soluzioni acquose
limitata resistenza a solventi
totale assenza di tossicità per le cellule in coltura
trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio
la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica
negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione
presenti nel siero)
L’adesione è un fenomeno attivo che
richiede l’interazione dei recettori di
membrana, le integrine, con le proteine
adesive, quali la fibronectine, adsorbite
sulla piastra di coltura.
Linee cellulari particolarmente utilizzate
3T
BHK21
HeLa
PtK1
L6
PC12
COS
CHO
HEK-293
fibroblast (mouse)
fibroblast (Syrian hamster)
epithelial cell (human)
epithelial cell (rat)
myoblast (rat)
chromaffin cell (derived from a rat pheochromocytoma)
fibroblast (monkey)
ovary (chinese hamster)
generated by transformation of embryonic kidney cells (human)
Conservazione delle cellule in azoto liquido
Per la conservazione delle cellule per lunghi periodi si ricorre allo stoccaggio in
azoto liquido (-196°C).
Il congelamento in azoto liquido mantiene le cellule vive in completa quiescenza
per anni.
Tramite congelamento, quindi, si può costituire uno stock di cellule che
mantengono le caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle cellule di partenza.
Le cellule prima del congelamento devono essere in fase logaritmica di crescita o
devono aver appena raggiunto la confluenza. Il congelamento viene fatto in
presenza di terreno di crescita, siero e agenti crioprotettivi (DMSO).
La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante perché
congelamenti troppo rapidi portano alla formazione di cristalli di ghiaccio (troppo
grossi) all’interno delle cellule, questi, al momento dello scongelamento,
provocano lisi della membrana plasmatica.
CONGELAMENTO
Il congelamento può essere letale per le cellule in relazione agli effetti
dannosi causati dai cristalli di ghiaccio.
Per minimizzare questi effetti, si possono prendere diverse precauzioni:
utilizzare un agente crioprotettivo in grado di abbassare il punto di
congelamento, come il glicerolo o il DMSO
Il medium di congelamento, che usualmente viene utilizzato è costituito da
90% siero, 10% DMSO
usare cellule in salute che stanno crescendo durante la fase logaritmica e
sostituire il medium 24 ore prima del congelamento
Le cellule devono essere portate lentamente dalla temperatura ambiente a 80°C, al fine di permettere all’acqua di uscire dalle cellule prima del
congelamento. Il tasso ottimale di raffreddamento è 1-3°C per minuto.
Per regolare il processo al tasso ottimale di congelamento attraverso una
periodica immissione di azoto liquido: camere di congelamento
Il Mr. Frosty è un contenitore riempito con 200 ml di isopropanolo a
temperatura ambiente e le vials di congelamento contenenti le cellule sono
posizionate in un rack posto all’interno del contenitore stesso.
Questo posto in un freezer -80°C. Il ruolo dell’isopropanolo è quello di
consentire alle vials di raggiungere la temperatura di congelamento
lentamente, circa 1°C al minuto. Una volta che il contenitore ha raggiunto 80°C (in 4 ore o più, overnight), le vials devono essere rimosse dal Mr.
Frosty e immediatamente poste nel bidone dell’azoto liquido. Le cellule sono
stoccate alle temperature dell’azoto liquido, perché lo sviluppo dei cristalli di
ghiaccio è ritardata al di sotto dei -130°C.
Il congelamento delle cellule è una tecnica utilizzata molto spesso nei laboratori di ricerca. Si tratta di un
protocollo semplice ma delicato perché in questi passaggi la sensibilità delle cellule è molto alta.
La soluzione di congelamento in cui vengono immerse le cellule è composta da siero bovino con l'aggiunta di un
agente crioprotettivo come per esempio il DMSO (dimetilsulfossido) o il glicerolo. La scelta del reagente dipende
dal tipo di cellule da congelare. Il glicerolo risulta essere meno tossico del DMSO.
Questa miscela riduce la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari ed extracellulari e in tal modo le cellule
risentono meno dello shock da scongelamento per cui sono in grado di riprendere le loro attività metaboliche e di
crescita.
Durante il congelamento, il metabolismo cellulare si ferma quando tutta l'acqua è convertita in ghiaccio. Esistono
altri metodi per bloccare il metabolismo cellulare come ad esempio la disidratazione o l'aumento della pressione
osmotica.
Il congelamento inoltre può avvenire con due diverse velocità: se avviene lentamente si forma poco ghiaccio
intracellulare ma si ha un forte sbilanciamento osmotico, questo perchè si ghiaccia prima l'acqua all'esterno della
cellula aumentando così la concentrazione di soluto extracellulare. Se il congelamento invece avviene
velocemente si ha meno sbilanciamento osmotico ma si forma più ghiaccio intracellulare che può essere dannoso
per le cellule.
Il congelamento deve mantenere elevata la vitalita' cellulare per tutto il periodo di
congelamento. E' molto importante sia la velocita' di congelamento che di scongelamento.
Per quanto riguarda il congelamento bisogna ricordare che il congelamento rapido porta
alla formazione di cristalli di ghiaccio all'interno della cellula, cristalli che, al momento
dello scongelamento, portano alla rottura della membrana plasmatica. Basse velocita' di
congelamento portano invece alla deposizione di ghiaccio nell'ambiente extracellulare, a
condizione pero' che la concentrazione interna di soluti sia sufficientemente alta da rendere
la concentrazione dell'acqua intracellulare minore di quella extracellulare. Questo processo
viene di solito controllato aggiungendo al terreno di congelamento un agente crioprotettivo
permeabile come il dimetilsolfossido (DMSO) o il glicerolo. Quando poi si formano i
cristalli di ghiaccio nel mezzo extracellulare, l'acqua viene sottratta alle cellule perche' la
tensione di vapore del ghiaccio e' piu' bassa di quella del citoplasma, prevalentemente
acquoso. L'acqua esce dalle cellule finche' le tensioni di vapore sono all'equilibrio.
Liquid nitrogen storage tank
Temperature = -196°C
Per massimizzare il recupero delle cellule dopo
lo scongelamento, le cellule devono essere
riscaldate molto rapidamente, posizionando le
vials direttamente dall’azoto liquido nel
bagnetto riscaldato a 37°C.
Non appena l’ultimo cristallo di ghiaccio si è
sciolto, le cellule devo essere diluite nel
medium di coltura pre-riscaldato.
Preparazione delle soluzioni
Preparazione del PBS ( Phosphate buffer saline) e delle
soluzioni per ELISA indiretto
Volume tot. 500ml
NaH2PO4 x H2O
P.M. 138 g/mol  1,9 mM
Na2HPO4 x 7H2O P.M. 268 g/mol  8,1 mM
NaCl
P.M. 58,4 g/mol  0,154 M
Questo PBS verra’ utilizzato per fare le seguenti soluzioni:
PBS-BSA al 3% (la BSA è una polvere)
PBS-BSA al 0,5%
vol. fin. 25 ml
vol. fin. 50 ml
PBS con TWEEN-20 allo 0,05%
vol. fin. 430 ml
Preparazione del Reagent Diluent dell’ELISA sandwich:
Diluire in acqua il Reagent Diluent 10X in modo da ottenere 50
ml di Reagent Diluent 1X
Reagent diluent 10X (Vf = 50 ml):
 BSA 0,1 %
 TWEEN 0,05 %
 Tris saline buffer
20 mM Trizma base (PM 121,14)
150 mM NaCl (PM 58,44)
H2O distillata
Trovare le quantità di ciascun componente per preparare 50 ml di
reagent diluent 10X