Enzimi di restrizione
• riconoscono sequenze specifiche, in
genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio
filamento.
• Queste sequenze sono generalmente
palindromi, cioè identiche se lette in
direzione 5'--> 3' sia su un filamento che
sull'altro.
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche
(sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi).
Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato:
EcoRI
E = genere Escherichia
co = specie coli
R = ceppo RY13
I = prima endonucleasi isolata
BamHI
B = genere Bacillus
am = specie amyloliquefaciens
H = ceppo H
I = prima endonucleasi isolata
GAATTC
CTTAAG
GGATCC
CCTAGG
Simmetria binaria
Tipi di taglio
•
•
•
•
-BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO
Es. SmaI
5’-CCC GGG-3’
5’-CCC-3’
5’- GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
3’-GGG-5’
3’-CCC-5’
• -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE:
• -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE)
• -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE)
– Es. Eco RI (5’ PROTRUDING)
• 5’-G/AATTC-3’
• 3’-CTTAA/G-5’
5’-G-3’
5’-AATTC-3’
3’-CTTAA-5’
3’-G-5’
– Es. Kpn I (3’ PROTRUDING)
• 5’-GGTAC/C-3’
• 3’-C/CATGG-5’
5’-GGTAC -3’
5’-C-3’
3’-C-5’
3’-CATGG-5’
Quante volte taglia un enzima
•
•
•
•
•
•
Probabilità di trovare un sito di restrizione:
basi
probabilità
4
(1/4)4 = 1/256
5
(1/4)5 = 1/1024
6
(1/4)6 = 1/4096
8
(1/4)8 = 1/65536
DNA ligasi
defosforilazione
Gel elettroforesi
Southern blot
• Il Southern Blot è una tecnica che
permette di identificare la presenza del
frammento di DNA che a noi interessa tra
una miscela di tantissimi frammenti.
Chimica del DNA
• Soluzione viscosa a pH 7
• Diminuzione viscosità a pH estremi o a T>
80°C
• Denaturazione ( aumento D.O)
• Rinaturazione (diminuzione D.O.)
• Formazione di ibridi anche tra catene di
specie diverse
• I nucleotidi vanno incontro a
trasformazioni chimiche (mutazioni)
DENATURAZIONE E
RINATURAZIONE
La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei
due filamenti complementari che lo costituiscono.
Il processo inverso è detto rinaturazione.
ANALISI FISICA
Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
1.2
50
1.1
1.0
40
60
Tm
80
Temperatura (°C)
0
100
Grado di denaturazione (%)
Temperatura di melting (Tm):
Temperatura in corrispondenza
della quale il DNA è denaturato
al 50%.
1.3
Assorbanza a 260 nm
Effetto ipercromico:
Aumento dell’A260nm durante il
processo di denaturazione del
DNA.
Curva di fusione
CINETICA di RINATURAZIONE
Curva C0t
Effetto ipocromico:
0
Diminuzione dell’A260nm durante il processo
di rinaturazione del DNA.
1) C0
2) Tempo
Concentrazione espressa in
nucleotidi/unità di volume
Rinaturazione (%)
Parametri che influenzano la
rinaturazione:
DNA a
rinaturazione
rapida
50
DNA a
rinaturazione
lenta
100
La misura della velocità di rinaturazione
può fornire utili informazioni circa la
complessità del DNA
-2
-1
0
1
2
Log Cot
3
4
5
forma A
forma B
forma Z
Senso elica
destrorsa
destrorsa
sinistrorsa
Diametro
26 A
20 A
12 A
Coppie di basi
per ogni giro
di elica
11
10.5
12
Distanza tra basi 2.6 A
3.4 A
3.7 A
Piegamento basi
rispetto all’asse
dell’elica
20°
6°
7°
Conformazione
dello zucchero
C-2’ endo
C-2’ endo per pirimidine
C-3’ endo per purine
anti
anti per pirimidine
sin per purine
C-3’ endo
Conformazione
Legame glucosidico anti
% ss DNA
rimanente
Cot
Fig. 13 Curva di Cot
SONDE E MARCATURA
• La sonda è un frammento specifico di DNA
(o RNA), reso radioattivo, capace di
riconoscere una sequenza complementare
di DNA o RNA in una popolazione di tanti
frammenti.
Metodi di marcatura
• Nick transaltion
• Random priming
• Marcatura terminale
nick con un -OH disponibile
5’P
3’OH
L’attività 3’5’ esonucleasica
rimuove il nucleotide
5’P
3’OH
L’attività 5’3’ polimerasica
sostituisce il nucleotide
5’P
3’OH
L’attività 5’3’ esonucleasica
sposta il nick verso il 3’
5’P
3’OH
-3’OH
-5P’
-3’OH
-5P’
-3’OH
-5P’
-3’OH
-5P’
5’P
-3’OH
3’OH
-5P’
Denaturazione ed appaiamento
degli esanucleotidi casuali
5’P
-3’OH
3’P
5’OH
Enzima Klenow + dNTP*
5’P
-3’OH
3’P
5’OH
MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
RANDOM PRIMING
Metodo dell’innesco casuale
5’3’-
NICK TRANSLATION
Spostamento dell’incisione
-3’
DNA
-5’
denaturazione
3’-TAGCAG-5’
aggiunta di inneschi
esanucleotidici
3’-GCATGC-5’
5’-TGCAGT-3’
-3’
5’3’-TAGCAG-5’
-5’
Frammento di Klenow,
dNTP
3’-TAGCAG-5’

5’-GCATAC-3’  

3’-
DNA sonda
marcato
5’3’-
GCAAG
CGCGTTC
GC
denaturazione

5’3’-

-5’
-3’
-5’
riempimento del buco prodotto con un
nucleotide radioattivo e rimozione del
nucleotide successivo
CAAG
CGCGTTC
GC G
-3’
-5’
il taglio si muove in
direzione 5’-3’
AAG
CGCGTTC
-3’
-5’
32P-dCTP
-5’




G
-3’
DNA
-5’
taglio di un’elica e rimozione
di un nucleotide mediante la
DNA polimerasi I
dGTP
-3’
5’-TGCAGT-3’ 
5’3’-
Sintesi DNA
5’3’-TAGCAG-5’
CGCGTTC
32P-dCTP
5’-GCATAC-3’
dATP
32P-dCTP
dTTP
dGTP
3’-
5’3’-
3’-TAGCAG-5’
3’-
GCGCAAG

ibridizzazazione
5’-GCATAC-3’
5’-TGCAGT-3’
5’3’-
GC G C
AG
CGCGTTC
-3’
-5’
5’P
-3’OH
3’OH
-5P’
Trattamento con fosfatasi
5’OH
-3’OH
3’OH
-5’OH
Polinucleotide chinasi+
[32P]dATP
5’P
3’OH
-3’OH
-5P’
• I tipi di marcatura non radioattiva sono
essenzialmente:
• -marcatura isotopica diretta (incorporazione di
nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo
chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di
una certa l);
• -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola
indicatrice e un precursore nucleotidico).
• I sistemi più usati sono:
• -Il sistema biotina-streptavidina
-La digossigenina
O
Uracile
O
NH
HN
PRINCIPIO DELLE SONDE
NON RADIOATTIVE:
Affinità molto elevate tra
Biotina e Avidina o Streptavidina
Uracile
HN
S
dUTP
O
N
Biotina
Desossiribosio
Trifosfato
B
B
B
B
C U C G A G A U G U C A U
G A G C T C T A C A G T A
DNA sonda
DNA target
Ibridazione del DNA sonda col
DNA bersaglio dei cromosomi
(A) Avidina-enzima
E
A
E
A
B
B
A U G U C
T A C A G
(B) Avidina-fluoroforo
E = molecole reporter
fosfatasi alcalina o
b-galattossidasi
F = molecole reporter
F
A
F
A
B
B
A U G U C
T A C A G
Ibridazione
• L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di
DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido
(doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione
di legame idrogeno per un certo numero di basi
complementari.
• L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA.
• L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA
non perfettamente complementari.
• Sono molto importanti le condizioni sperimentali.
Condizioni stringenti
• Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni
sperimentali che permettono la migliore ibridazione.
• Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore
percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):
– maggiore Temperatura
– minore concentrazione salina
– presenza di denaturanti chimici
• Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore
percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):
– minore Temperatura
– maggiore concentrazione salina
– assenza di denaturanti chimici
Mappe di restrizione in diagnostica
...MAPPATURA di RESTRIZIONE
TRATTAMENTO
Nessuna digestione
Enzima A
DIMENSIONE dei
FRAMMENTI (Kb)
INTERPRETAZIONE
9
9
A
2+7
2
7
A B
Enzima B
3
3+6
6
B
A
3
6
A
B
1+2+6
2
Enzima A+ B
1
B
A
2+3+4
2
4
6
3
Sequenziamento
con isotopi radioattivi
a = adenina
c = citosina
g = guanina
t = timina
g t a c gtacg tacg tac
MICROSATELLITE
ripetizione: adenina e citosina
acacacacacacacacacacacacacacac
dinucleotide :(ac)15
1) ESTRAZIONE DEL DNA
Sangue
Peli
Seme
DNA
Doppia
Elica
2) PCR
Polymerase Chain Reaction
Individuo A
3 paia di
cromosom
i
omologhi
3) ELETTROFORESI
Individuo B
Individuo C
campione di controllo
Sequenziatore Automatico
Elettroferogramma
di un campione con 12 microsatelliti
Immagine Computerizzata
dell’ elettroforesi
PADRE
MADRE
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 263/277
DIAGNOSI POSITIVA
FIGLIO
GENOTIPO: 263/263
FIGLIO
GENOTIPO: 263/277
Profilo genetico di un campione
PADRE
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 128/140
PADRE
128
263
GENOTIPO: 128/146
GENOTIPO: 263/277
MADRE
MADRE
128
263
146
277
FIGLIO
263
GENOTIPO: 128/128
128
GENOTIPO: 263/263
FIGLIO
140
FIGLIO
GENOTIPO: 124/128
124
128
GENOTIPO: 263/277
FIGLIO
263
277
FIGLIO
GENOTIPO: 128/128
128
DIAGNOSI POSITIVA
DIAGNOSI NEGATIVA