Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
T
G
C
A
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
5’
3’
TTACGTAACGTCA
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’
3’
TTACGTAACGTCA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’
3’
TTACGTAACGTCA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
dATP
dCTP
dGTP
dTTP + DNA Polimerasi
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
5’
3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’
3’
TTACGTAACGTCA
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
3’
5’
dA dC
dG
dT
dATP dCTP
dGTP
ddATP ddCTP ddGTP
dTTP + DNA Polimerasi
+ DNA Polimerasi
ddTTP
TTACGTAACGTCAG
14
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGA
15
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAA
16
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAAC
17
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACG
18
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACGT
19
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
TTACGTAACGTCAGAACGTC
20
AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
Elettroforesi
-
Laser
Fluorimetro
+
A
C
G
T
Elettroforesi
Lettura
G
Laser
Fluorimetro
+
A
C
G
T
Elettroforesi
Lettura
GAAC
Laser
Fluorimetro
+
Elettroferogramma
Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
T
G
C
A
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
- Fluorocromi (marcatura diretta)
- Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina)
- Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici
marcati con fluorocromi o enzimi)
- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con
fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati
Fluorocromi
Strategie di marcatura
Marcatura delle estremità mediante polinucleotide chinasi
Strategie di marcatura
Sintesi di DNA mediante random priming
Strategie di marcatura
Nick Translation
5’
3’
5’
3’
3’
5’
DNAsi I
3’ 5’
3’
5’ 3’
E. Coli Pol I
Attività esonucleasica 5’-3’ + nucleotidi marcati
Attività polimerasica 5’-3’
5’
3’
3’ 5’
5’ 3’
5’
3’
5’
Strategie di marcatura
PCR
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
Vantaggi: elevata attività specifica, necessarie poche molecole di stampo
Strategie di marcatura
Sintesi di RNA antisenso mediante RNA polimerasi
Strategie di marcatura
Sintesi di cDNA mediante transcrittasi inversa
Tecniche di rivelazione degli acidi nucleici basate
su ibridazione dopo separazione elettroforetica
mediante gel di agarosio. Il Southern blot
analizza il DNA, il Northern blot l’RNA.
Strategia generale
Preparazione dei campioni prima della
corsa elettroforetica
1. Nel southern blot il DNA (sia genomico che
plasmidico) viene digerito con enzimi di
restrizione.
2. Nel northern l’RNA deve essere denaturato. Si
può usare RNA totale o RNA messaggero
purificato (PolyA+)
Cella elettroforetica per gel di agarosio
DNA
genomico
M
E6
-
E4
10
9
8
7
6
5
28S
4
3
18S
2
DNA satellite
1
7S
+
Trasferimento capillare da gel di agarosio
Trasferimento elettrico da gel di agarosio
Membrana dopo trasferimento
Marcatura della sonda tramite
random priming
SOUTHERN BLOT
RFLP= restriction fragment length polymorphism
Individuazione diretta di mutazioni patogene tramite
identificazione di RFLP
In rari casi la mutazione patogena può abolire o creare un sito di
restrizione
I polimorfismi delle VNTR (Variable number of Tandem Repeat)
-DNA genomico viene digerito con enzimi ben conservati che
Fiancheggiano uno specifico locus VNTR.
-Lo schema di RFLP non dipende da RSP, bensì da numero di
volte un cui una unità è ripetuta in tandem
-sonda: sequenza unica del locus
DNA FINGERPRINT (impronta digitale del DNA)
-Se il locus VNTR fa parte di una famiglia di DNA ripetitivo, si
può usare come sonda una unità ripetuta, al posto di una seq
unica del locus
-Si produce uno schema polimorfico complesso che permette
di discriminare tra due individui qualsiasi che non siano gemelli
identici