SCIENZE NATURALI ED UMANE
Ambiente fisico e biologico: interazioni con le attività umane nel
passato e nel presente
UNITA’ BIOMEDICA: La Microscopia
applicata alle scienze biomediche, quale
mezzo di studio per l’ambiente biologico.
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Sommario
Parte Teorica (1a lezione)
1) Il microscopio ottico come punto di partenza
2) Dal microscopio ottico al microscopio elettronico: Principi di funzionamento di TEM e
SEM
3) Il microscopio confocale (CLSM): principi di funzionamento
4) Principi di immunocitochimica: metodiche di evidenziazione di molecole e strutture
cellulari per l’osservazione al CLSM
5) Esempi applicativi di TEM, SEM e confocale a ricerche in campo biomedico
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Scala logaritmica delle dimensioni
1mm
Limite dell ’occhio umano
75 m
Onde
radio
100 m
Cellule epiteliali 40 m
Infrarosso
Limite microscopio ottico a luce
bianca
 1m
10 m
Emazie 6-7 m
1 m
Batteri 2m
Visibile
Limite microscopio ottico a luce
ultravioletta
Ultravioletto
0,2-0,1m
0,1 m (1000 )
Micoplasmi 0,1-0,2 m
Virus 0,1-0,01m
0,01 m (100 )
0,001 m (10 )
Limite microscopio elettronico
4
0,0001 m (1 )
Proteine
0,005-0,01m
Aminoacidi
8-12 
Atomi
1-4 
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Un po’ di storia...
Il microscopio ottico come punto
di partenza
Microscopio ottico semplice: 5 secoli fa
Microscopio ottico composto: alla fine del 1600 ad opera dei fratelli Jonssen in
Olanda e Galileo Galilei in Italia
Dal 18° secolo in poi la microscopia ottica ha raggiunto livelli di grande qualità,
dovuti allo sviluppo di componenti ottici e meccanici.
Dalla fine 19° secolo la competizione ha permesso una produzione qualitativamente
alta e a prezzi contenuti
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Dal microscopio ottico al microscopio
elettronico: Principi di funzionamento
di TEM e SEM
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Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Un po’ di storia...
Berlino 1931: Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), intuisce che un campo
elettromagnetico funzionava come una lente per gli elettroni.
7 Aprile 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima
foto al micr. Elettronico (17.400 X) Nascita della Microscopia Elettronica
1933: E. Ruska sviluppa il vero prototipo di Microscopio Elettronico a
Trasmissione (TEM)
1939: TEM disponibile sul mercato
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Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Un po’ di storia...
Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia
della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la
costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).
1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento
1965 il SEM diventa commercialmente disponibile
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Confronto tra MO, TEM e SEM
Elettronico
a trasmissione
Ottico
Elettronico
a scansione
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Microscopio Elettronico
a Trasmissione
REQUISITI DEL CAMPIONE: sezioni sottili (60-80nm) di materiale incluso in resine
plastiche, oppure preparati liberi di spessore molto limitato.
INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla struttura interna del campione.
SISTEMA ILLUMINANTE: sorgente ottenuta da un filamento di tungsteno riscaldato sotto
vuoto. Il fascio elettronico originato viene focalizzato sul campione mediante lenti
elettromagnatiche.
SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine della zona osservata
viene ottenuta in modo simultaneo su di un apposito schermo fluorescente sotto il campione.
LIMITE DI RISOLUZIONE: in relazione ai parametri di osservazione scelti può essere
molto elevato: 0,2-0,3nm.
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Modificazioni subite da un fascio elettronico
primario che interagisce con un materiale
DIFFUSIONE ANELASTICA (e- - e- orbitale esterno atomo):
 Diminuzione di energia senza apprezzabile perdita di direzione.
DIFFUSIONE ELASTICA (e- - nucleo atomico):
 Variazione di direzione senza apprezzabile perdita di energia.
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Segnali emessi da un campione biologico colpito da un fascio
di elettroni
Elettroni Secondari (SE) fascio di elettroni primario - e- orbitali esterni. Bassa
energia  50 eV. Informazioni da stati superficiali (10 nm) MORFOLOGIA DI
SUPERFICIE
Elettroni Retrodiffusi o backscattered (BSE) urti elastici Energia  50 eV.
Informazioni di tipo compositivo o morfologico di strati profondi (alcuni m.
Catodoluminescenza presenza di sostanze luminescenti
Radiazioni X emissione di SE da orbitali interni: a seconda dello spettro di r. X
emesse si può risalire agli elementi costituenti il campione (MICROANALISI)
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Microscopio Elettronico
a Scansione
REQUISITI DEL CAMPIONE: frammenti di materiale da pochi mm3 sino all’ordine di cm3
(per i campioni biologici, da cellule in coltura a frammenti di tessuti).
INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative, nella modalità principale di osservazione, alla
superficie del campione, con la formazione di immagini di aspetto tridimensionale.
SISTEMA ILLUMINANTE: stessa sorgente del TEM
SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: non esistono lenti magnetiche al di
fuori di quelle utilizzate per la focalizzazione del fascio. L’immagine viene ottenuta sulla superficie
di un tubo a raggi catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal
campione.
LIMITE DI RISOLUZIONE: in relazione ai vari parametri di osservazione scelti può essere
da 5 a 30nm.
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Elettronico a trasmissione
Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in
seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici
degli stessi
Localizzazione di molecole interne a cellule o tessuti preventivamente marcati
Osservazione di virus
Elettronico a scansione
Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti
farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti
Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati
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Il microscopio confocale (CLSM):
principio di funzionamento
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Microscopio Confocale
Laser (CLSM)
REQUISITI DEL CAMPIONE: tecnologia non invasiva, consentendo l’osservazione del preparato a pressione ambiente, è
ideale per lo studio di campioni biologici viventi (es. cellule in coltura) rendendo accessibile lo studio dinamico dei fenomeni vitali.
Inoltre, sono osservabili tutti i campioni i cui componenti, strutturali e non, siano stati in qualche modo “colorati “ con sostanze o capaci
di emettere luce colorata se colpite da un raggio laser (fluorocromi) od in grado di deviare il laser stesso (es. atomi ad alto peso
molecolare come oro, argento, platino, cadmio)
INFORMAZIONI OTTENIBILI: relative alla distribuzione, nell’intero volume del campione (sia esso un frammento di
tessuto o cellule in coltura) di componenti strutturali e non dello stesso capaci di emettere, da soli od in seguito ad opportune
colorazioni, un segnale luminoso quando colpito da un raggio laser.
SISTEMA ILLUMINANTE: una sorgente di luce laser costituita da una miscela di gas tale da generare raggi luminoso
nell’intero spettro della luce viusibile od ultravioletta.
SISTEMA DI FORMAZIONE DELL’IMMAGINE: l’immagine viene ottenuta sulla superficie di un tubo a raggi
catodici, mediante elaborazione elettronica del segnale proveniente dal campione.
LIMITE DI RISOLUZIONE: circa 0,2m
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Il laser: la sorgente luminosa
Si utilizzano lasers a gas ionizzato e ciascun tipo di laser ha delle linee di emissione per un
limitato numero di .
Tipi di lasers:
ARGON
Blu (488nm) e Verde (514nm)
He-Ne
Verde (543nm) e Rosso (633nm)
KRIPTON
Giallo (568nm) e Rosso (647nm)
ARGON ad alta potenza
Ultravioletto  < 400nm
ELIO-CADMIO
Necessitano di un sistema di raffreddamento liquido (molto
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costosi)
Microscopio Confocale
Laser (CLSM)
Vantaggi
Informazioni relative ai vari piani focali del campione
(informazioni di profondità)
Maggiore nitidezza delle immagini
Struttura tridimensionale del campione
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Microscopio confocale laser
 Localizzazione di molecole autofluorescenti o marcate con
sonde fluorescenti
 Visualizzazione di strutture cellulari (es. citoscheletro)
 Osservazioni sul ciclo cellulare (marcatura del nucleo con
opportuni coloranti fluorescenti)
 Apoptosi
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Sommario
Parte Teorico-pratica (2a lezione)
1) Cenni introduttivi per la preparazione di campioni per TEM e SEM
2) Osservazione diretta di campioni biologici al SEM
3) Passaggi fondamentali per la preparazioni di campioni biologici per il SEM
4) Colorazioni citologiche per l’osservazione al microscopio ottico
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Fasi principali della preparazione di campioni per la
Microscopia Elettronica a Trasmissione ed a Scansione
1) Prelievo
Particolare cura nell’evitare traumatizzazioni della zona da esaminare
Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per
attuare un’adeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resina
Delicata pulizia del campione con soluzione fisiologica o tampone
Le suddette operazioni devono essere eseguite in tempi brevi
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2) Fissazione
Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e
macromolecolari dell’architettura cellulare, provocando l’arresto istantaneo
di tutte le attività chimico-fisiche cellulari
Tipi di fissativi (+ usati):
a) GLUTERALDEIDE 2-4%  reticola le proteine
b) TETROSSIDO DI OSMIO 1-2%  fissa lipidi e proteine
I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone.
Principali tamponi:
a) Tampone fosfato (+ usato);
b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato);
c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)
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3) Disidratazione
Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione,
per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione (trasmissione),
ricopertura (scansione) e osservazione sotto vuoto.
Passaggi:
Etanolo 50% 10min
“
70% 10min
“
85% 10min
“
90% 10min
“
95% 10min
“ 100% 2x20min
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4a) Inclusione in resina
La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine
sottili. Si effettua un’impregnazione nei monomeri resinosi (fluidi) che
verranno successivamente polimerizzati e resi solidi.
Passaggi:
Etanolo 100% + Acetone assoluto (1:1) 15min
Acetone assoluto (rischiarante, miscibile con le resine) 15min
Resina + Acetone (1:1), 24h
Resina pura 24-48h
Resina da inclusione 3-4gg in stufa a 70°C
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5a) Taglio con ultramicrotomo
2 Tipi di sezioni:
A) Semi-fine  ottico, colorandole con blu di metilene, spessore 1-2m
B) Fine  elettronico, spessore 400-600nm (0,4-0,6m)
6a) Contrasto
Mediante applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato peso atomico (Acetato di uranile e citrato
di piombo)
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4b) Critical Point Drying
Completa la disidratazione del campione, permettendo di mantenere il più possibile inalterata la superficie del campione
Passaggi:
Etanolo assoluto + Acetone assoluto (1:1) 15min
Acetone assoluto 15min
CPD in CO2 liquida
5b) Montaggio
Mediante vernicette colloidali costituite da elementi conduttivi (Ag, Cu, C) o nastri adesivi.
Attacco del campione al substrato
Assicura la conducibilità termica ed elettrica
6b) Ricopertura
Perché la ricopertura:
 conducibilità elettrica del campione  minori effetti di carica
 danneggiamento termico
 emissione elettronica secondaria
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Fasi principali della preparazione di campioni per la
1) Fissazione
Un fissativo ottimale deve:
A) Mantenere l’antigenicità del campione
B) Minimizzare la comparsa di artefatti.(es. la gluteraldeide dà origine a derivati
autofluorescenti  da non usare)
In genere si usa paraformaldeide (2-4%) o metanolo a freddo
2) Immunomarcatura
Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione
Antigeni di superficie: immunomarcatura e poi fissazione
3) Controcolorazione,
per evidenziare strutture cellulari (nucleo, citischeletro etc.)
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