Diss. ETH No. 9199
Aspects
of pathogenesis and host resistance in
the interaction between Venturia
inaequalis
and
apple leaves.
a
dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY,
ZÜRICH
for the
degree of Doctor in
Natural Science
by
Claudio
Dipl.
bom
Valsangiacomo
sc.
nat. ETH
January 30th, 1962
swiss Citizen
Accepted on
the recommendation of
Prof. Dr. M.S.
Dr. C.
Wolfe, examiner
Gessler, co-examiner
Prof. Dr. R.
Amado, co-examiner
Zürich, 1990
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-1
-
Summary
SUMMARY
inaequalis is the causal agent of apple scab, the most import¬
ant disease of apples. In order to reduce chemical control of this fungal
pathogen, resistant varieties exhibiting acceptable fruit quality have been
Venturia
selected in the last deeades. Most of the eultivars selected up to now con¬
tain the genetic resistance Vf, introduced from the wild species Malus
floribunda. However, mechanisms controiled by this resistance and by on¬
togenie resistance (typical of mature apple fruits and adult leaves of any
cultivar) are still unknown. This work attempts to provide information on
the physiology of scab, so as to facilitate investigations of scab resistance.
By means of transmission electron microscopy (TEM), the process of
penetration of the cuticular membrane in the early stages of infection was
investigated, comparing susceptible, Vf-resistant and ontogenie resistant
apple leaves. In these studies it was found that infection structures origin¬
ating from conidia gain entrance through the intact cuticular membrane of
of scab susceptible
young actively growing and fully developed leaves
resistant
and
scab
(Liberty) apple eultivars. Initial
(Golden Delicious)
in
both
similar
was
stromal development
eultivars, being most frequent in
and
leaves
the young growing
decreasing with their ageing. Expression of
both Vf- and ontogenie resistance seems to occur after penetration of the
cuticular membrane.
during the postinfectional stages of pathogen¬
locaiized host cell wall break-down. This process of wall
Cwas analyzed in vitro by developing a method involving
TEM studies carried out
esis indicated
degradation
a
apple trees grown under C02-atmosphere. Comparative studies on the degradability of cell walls from a
susceptible and a resistant variety did not show any correlation of degra¬
dability with resistance.
Further, this method confirmed the involvement in cell wall degradation
of an exo-polygalacturonase produced by V. inaequalis. The enzyme, puri¬
fied to homogeneity from liquid cultures, was extracted from both the cul¬
ture filtrate and, for the first time, from the myceliai fraction. Purification
involved three steps of column chromatography: gel filtration (Sephadex
G25), ion-exchange (DEAE CL-6B) and affinity chromatography (crosslinked alginate). The homogeneous enzyme was characterized by deter¬
mining its molecular weight and optimal activity conditions, the mode of
action (endo-exo) on the substrate and by immunological studies with an
antiserum produced against an alien polygalacturonase.
Further, crude protein extracts from uninfected apple leaves and fruits
showed in vitro polygalacturonase inhibitory activity. The proteinaeeous
inhibitor inhibited more effieiently the polygalacturonase from Aspergillus
labelled cell walls extracted from
Summary
niger
than that from V.
-
2
inaequalis. Polygalacturonase inhibiting proteins
produced by tomatoes and Red Kidney beans were also tested against the
polygalacturonase from V inaequalis. Potential involvement of this inhibi¬
tor in apple resistance against scab is discussed.
Riassunto
RIASSUNTO
Venturia
inaequalis
ridurre
negli
stenti
e
maggior
l'impiego della
ultimi decenni
su
lotta chimica contro
sono State
questa malattia
a
della ticchiolatura del melo, la
questa pianta da frutto. AI fine di
l'agente patogeno
rilievo riscontrata
malattia di
e
questa malattia crittogamica,
selezionate diverse varieta di melo resi-
qualitativamente competitive.
parte delle cultivar selezionate sinora
e
Nella
maggior
tipo
stata introdotta la resistenza di
specie selvatica Malus floribunda. I meccanismi responsabili per
la resistenza
questo tipo di resistenza come pure quelli responsabili per
di
adulte
maturi
e
ogni melo) sono tut¬
foglie
ontogenica (propria di frutti
nel colmare la
tentativo
un
tavia sconosciuti. Questo lavoro rappresenta
facilitando
della
sulla
ticchiolatura,
mancanza di informazioni
fisiologia
Vf dalla
cosi la ricerca sulle resistenze
a
questa malattia.
a trasmissione (TEM) e stato studiamicroscopia
cuticolare nei primi stadi
membrana
della
penetrazione
con resistenza ontogeni¬
in
foglie
dell'infezione, paragonando
particolare
ca e Vf. Da questi studi risulta che la membrana cuticolare viene sempre
La for¬
penetrata, indipendentemente dal grado di resistenza della foglia.
mazione iniziale di stroma era simile in ambedue i cultivar (Liberty e
Golden Delicious, rispettivamente Vf resistente e suscettibile alla ticchio¬
latura), era tuttavia piü frequente sulle foglie giovani mentre si riduceva
sulle foglie adulte. L'espressione della resistenza, sia di tipo Vf che onto¬
genica, sembra quindi apparire solo dopo la penetrazione della membrana
elettronica
Tramite la
to il processo di
cuticolare.
epidermiche dell'ospite sottostanti uno
appaiono localmente degradate, come evidenziato da studi TEM. Questo processo di degradazione e stato in seguito
studiato in vitro per mezzo di un metodo sviluppato appositamente. Le
pareti cellulari usate in questo metodo venivano estratte da foglie di melo
CO2. Studi comparativi sulla degradabilitä
cresciute sotto atmosfera con
delle pareti cellulari provenienti da foglie con diverso grado di resistenza
Le
pareti cellulari
stroma
vivente
e
delle cellule
ben strutturato
(Vf e ontogenica)
non
hanno tuttavia evidenziato
degradabilitä e resistenza.
Qesto metodo ha permesso di dimostrare
poligalatturonasi prodotta da V. inaequalis
della parete cellulare. L'enzima, purificato
il
nessuna
eorrelazione
coinvolgimento
di
di
cromatografia
passaggi
(Sephadex G25), scambio ionico (DEAE CL-6B)
finitä (alginato reticolato). L'enzima omogeneo
determinando le condizioni ottimali di
una exo-
nel processo di degradazione
da colture in vitro, b stato e-
stratto sia dalla frazione miceliare sia dal medio nutritivo. La
zione comportava tre
tra
su
e
e
purifica-
colonna: filtrazione
cromatografia
di af-
stato caratterizzato
attivitä, il peso molecolare, la
mo-
Riassunto
dalitä di attacco del substrato
(exo-endo) ed effettuando studi immuno-
logici
na.
per mezzo di un antisiero prodotto contro una poligalatturonasi alieII ruolo di questo enzima nella patogenesi e discusso.
Estratti
proteici grezzi
ottenuti da
foglie e frutti di melo hanno presenpoligalatturonasi. L'inibitore protei¬
co inibiva piu efficientemente la poligalatturonasi di
Aspergillus niger che
quella di V inaequalis. Proteine inibitorie di poligalatturonasi prodotte dal
fagiolo e dal pomodoro sono pure state saggiate contro la poligalatturona¬
si di V inaequalis. II Potenziale coinvolgimento di
questo inibitore nella
tato in
vitro un'attivitä inibitoria della
resistenza del melo alla ticchiolatura b discusso.