THE ROLE OF STATHMIN
IN THE REGULATION
OF THE CELL CYCLE
INTRODUCTION
STATHMIN: IMPORTANT MOLECULE
CELLULAR FUNCTIONS WELL-DOCUMENTED
REGULATION OF MT DYNAMICS
REGULATION OF CELLULAR PROLIFERATION
REGULATION OF CELL CYCLE PROGRESSION
1
INTRODUCTION
CELLULAR FUNCTIONS EQUALLY IMPORTANT
BUT
MUCH LESS CHARACTHERIZED
MIGRATION
DIFFERENTIATION
… in spite of these important functions
stathmin protein remains OBSCURE…
STATHMIN
REGULATORY DOMAIN
PHOSPHORYLATION
INTERACTION DOMAIN
TARGETS/PARTNERS
BIOLOGICAL RESPONSES
2
STATHMIN
p17, p18, p19, 19K, metablastin, oncoprotein 18, Lap18,
Op18/stathmin
19-kDa CYTOSOLIC PROTEIN
ST14A CELL LINE: strong and diffuse staining, more intense around the nucleus
INTERPHASE
MITOSIS
STATHMIN
DURING MITOSIS STATHMIN IS HIGH PHOSPHORYLATE
ST14A CELL LINE: staining of mitotic but not interphasic cells
3
STATHMIN AND CELLULAR PROLIFERATION
SEVERAL OBSERVATIONS SUGGEST A CLOSE LINK BETWEEN
STATHMIN EXPRESSION AND REGULATION OF CELL
PROLIFERATION
•Leukemic cell lines: stathmin expression decreases when cells cease
to proliferate (Luo et al., 1991) and increases when cells are induced to
proliferate (Hanash et al., 1988)
•Undifferentiated multipotential embryonal carcinoma cell lines:
stathmin expression decreases upon induction of differentiation
•Poorly differentiated tumors: high proliferative activity and high
level of stathmin expression
STATHMIN AND CELLULAR PROLIFERATION
Normal tissues: high level of stathmin expression in tissues with
high cell turnover than in non-proliferative tissues
EPITHELIUM: stathmin expression in the proliferative compartment
Neonatal tissues express much higher level of stathmin relative to
adult tissues.
O.E.
O.E.
P5
P30
4
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
MTs consist of α/β tubulin heterodimers which exist in a state of
continuous transition between phases of polymerization and
depolymerization
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
•INTERPHASE: MT dynamics of growth and shrinkage are relatively
slow
•AT THE ONSET OF MITOSIS: MTs are highly dynamic, the rate of
depolymerization is increased
5
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
Belmont & Mitchison 1996:
… searching for molecular factors promoting an increased catastrophe
rate of mitotic microtubules…
purified STATHMIN from Xenopus eggs extracts and characterized it as
a PROTEIN that PROMOTES MTs depolymerization by increasing the
rate of catastrophe
1. STATHMIN PROTEIN EXTERTS ITS MITOTIC EFFECTS INCREASING
THE RATE OF CATASTROPHE
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
Jourdain 1997:
STATHMIN depolymerizing activity is mediated trough a DIRECT
SEQUESTRATION of tubulin
T2S COMPLEX
2. STATHMIN PREVENTS MTs POLYMERIZATION BY DIMINISHING
THE INTRACELLULAR POOL OF TUBULIN
6
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
Howell 1999:
STATHMIN EXERTS TWO DISTINCT ACTIVITY
GTP hydrolysis-dependent
activity
α-helix domains
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
3. STATHMIN IS CAPABLE OF PREVENT POLYMERIZATION AND/OR
PROMOTE DEPOLYMERIZATION
7
STATHMIN AND MICROTUBULE DYNAMICS
ACTIVE
STATHMIN
P
STATHMIN
INACTIVE
STATHMIN AND CELL CYCLE REGULATION
Luo et al., 1994
K562 erytroleukemia cells: the level of stathmin phosphorylation
increased markedly when cells enter the mitotic phase of the cell
cycle
Brattsand et al., 1994
HeLa cells: the level of stathmin phosphorylation peaks in mitosis
Marklund et al., 1996
When cells enter mitosis, the MT-depolymerizing activity of stathmin
is switched off by phosphorylation, allowing MTs to polymerize and
assemble into a mitotic spindle
The expression of a constitutively active form of stathmin prevents
cell cycle progression
8
STATHMIN AND CELL CYCLE REGULATION
STATHMIN AND CELL CYCLE REGULATION
Ser16 Ser25 Ser38 Ser63
9
VERTICAL AND HORIZONTAL
GRADIENTS FOR STATHMIN
EXPRESSION DURING CELL CYCLE
PROGRESSION IN THE RAT NEURONAL
PROGENITOR CELL LINE ST14A
TO FURTHER INVESTIGATE THE FUNCTION AND MECHANISM OF
ACTION OF STATHMIN DURING THE CELL CYCLE, WE EXAMINED
ITS INTRACELLULAR LOCALIZATION IN ST14A CELL LINE
ST14A CELLS EXPRESS STATHMIN
STATHMIN IS HYPERPHOSPHORYLATED DURING MITOSIS (a-S16P2)
10
STATHMIN AND CELL CYCLE REGULATION
STATHMIN PHOSPHORYLATION REGULATES CELL CYCLE PROGRESSION
KINASES
16 25 38 63
16 25 38 63
STATHMIN
STATHMIN
25 38
STATHMIN
MITOTIC
SPINDLE
G2
M
S
PHOSPHATASES
STATHMIN
G1
KINASES
25 38
STATHMIN
CONFOCAL MICROSCOPY
CONFOCAL MICROSCOPY IS A STANDARD TECHNOLOGY FOR
HIGH RESOLUTION OBSERVATIONS OF LIVING OR FIXED
BIOLOGICAL SAMPLES. IT ALLOWS VOLUME RECONSTRUCTIONS
AND TIME SEQUENCING, TWO FEATURES THAT PROVED TO BE
EXTREMELY POWERFUL WHEN APPLIED TO THE STUDY OF LIVING
CELLS, TISSUES OR ORGANISMS.
A CONFOCAL MICROSCOPE DIFFERS FROM A TRADITIONAL
FLUORESCENCE MICROSCOPE FOR THE USE OF A LASER AS A
LIGHT SOURCE AND FOR THE PRESENCE OF AN OPTICAL AND
ELECTRONICAL SYSTEM THAT ALLOWS THE OPTICAL SCANNING
OF A SAMPLE SECTION AND ITS RECONSTRUCTION ON A
COMPUTER DISPLAY.
11
CONFOCAL MICROSCOPY
ww.bioveg.unito.it
STATHMIN AND MTs INTERACTIONS
STATHMIN/TUBULIN
STATHMIN PUNCTATE STAINING DOES NOT APPEAR ORGANIZED
INTO A CLEAR NETWORK, PARTIAL COLOCALIZATION WITH MTs
12
STATHMIN AND MTs INTERACTIONS
The reorganization of MTs into bundles after taxol treatments
increased the stathmin association with the polymerized fraction
of tubulin
STATHMIN AND NUCLEAR CHANNELS
The analyses of stathmin
subcellular localization by
confocal laser scanning
microscopy suggest that the
nuclear envelope of
interphasic ST14A cells
contains long and dynamic
membrane channels
13
STATHMIN AND NUCLEAR CHANNELS
STATHMIN
SYTOX ORANGE
STATHMIN AND NUCLEAR CHANNELS
nuclear channels have been
observed in living ST14A cells
transiently transfected with a
GFP-stathmin fusion construct
and so cannot be artefacts of
the fixation or
immunocytochemistry
14
STATHMIN AND NUCLEAR CHANNELS
3D ANALYSES
AND
RECONSTRUCTION
STATHMIN AND NUCLEAR CHANNELS
STATHMIN PROTEIN IS ALSO LOCALIZED IN THE LUMEN OF THESE
NUCLEAR CHANNELS, WHICH, IN THE ST14A CELL LINE, RESULTED
TO BE ORIENTATED PREDOMINANTLY VERTICALLY WITH RESPECT TO
THE GROWTH SUBSTRATE
15
STATHMIN GRADIENTS
STATHMIN GRADIENTS
3D RECONSTRUCTION TECHNIQUES TO STACKS
OF SERIAL SECTIONS RECORDED BY A CONFOCAL
MICROSCOPE FROM ST14A CELLS
IMMUNOLABELLED FOR STATHMIN EVIDENCE THE
PRESENCE OF VERTICAL AND HORIZONTAL
INTRACELLULAR GRADIENTS FOR STATHMIN
SPATIAL ORGANIZATION DURING CELL CYCLE
PROGRESSION
16
STATHMIN GRADIENTS
STATHMIN SHOWS A SPATIAL DISTRIBUTION
THAT IS SPECIFIC OF THE CELL CYCLE STEP
STATHMIN GRADIENTS
17
STATMINA
1.
SISTEMA GnRH
2.
REGOLAZIONE DELLA
STATMINA
DURANTE LA
MIGRAZIONE
SISTEMA GnRH
GnRH cells
POST-MITOTIC MIGRATING CELLS
hypothalamic-pituitary-gonadal axis
FSH
LH
Reproductive functions
18
1. SISTEMA GnRH
cellule POST-MITOTICHE
esprimono statmina…
merge
GnRH
… quando MIGRANO
Placode olfattivo
STMN
Bulbo olfattivo/ forebrain
Regione ipotalamica
neuroni
afferenti
vasi
pituitari
MIGRAZIONE
STATMINA
19
1. SISTEMA GnRH
L’espressione di statmina correla con l’attività
migratoria dei neuroni GnRH in vivo
Che effetti hanno sulla migrazione
modificazioni dell’espressione di
statmina?
APPROCCIO FUNZIONALE IN VITRO
1. SISTEMA GnRH
Linea cellulare GNGN-11
“… modello utile per lo studio specifico dell’attività
migratoria dei neuroni GnRH in vitro…”
“… modello utile per lo studio in vitro dei meccanismi
generali che regolano la migrazione neuronale…”
(Pimpinelli et al., European Journal of Neuroscienze, 2003)
• modificazione del livello di statmina
(STMN+; ctrl; STMN-)
• analisi della proliferazione
• analisi della morfologia
• analisi della migrazione
• saggi di chemiotassi (HGF/SF)
20
STATHMIN
STATHMIN
VECTOR
VECTOR
sense
empty vector
Stathmin
overexpression
control
VECTOR
antisense
Stathmin
downregulation
STMN-
STMN+
1. SISTEMA GnRH
PROLIFERAZIONE
L’inibizione della statmina mediante antisenso riduce la
proliferazione delle cellule STMNModello linea cellulare K562: STMN+ aumento proliferazione
STMN- diminuzione proliferazione
(Mistry et al., 2002)
21
1. SISTEMA GnRH
ANALISI MORFOLOGICA
Diametro max
Diametro min
Area
Perimetro
22
1. SISTEMA GnRH
PROFILO di ESPRESSIONE delle CADERINE
1. SISTEMA GnRH
MIGRAZIONE
Metodo TRANSWELL: motilità basale
saggi di chemotassi
MIGRAZIONE
PARADIGMA SPERIMENTALE: HGF/SF come stimolo
(Giacobini et al., 2002)
23
1. SISTEMA GnRH
MIGRAZIONE
ATTIVITA’ BASALE
CHEMOTASSI
C’è una CORRELAZIONE DIRETTA tra la variazione di
espressione di statmina e la migrazione
1. SISTEMA GnRH
MIGRAZIONE
La variazione di statmina NON modifica la
capacità delle GN-11 di aumentare la
migrazione in risposta all’HGF
La variazione di statmina agisce sulla motilità
cellulare a livello generale
24
STATMINA
2.
REGOLAZIONE
DELLA STATMINA
DURANTE LA
MIGRAZIONE
L’attività della statmina è regolata tramite fosforilazione su
4 diverse serine.
L’ordine di fosforilazione è unico e rigidamente stabilito.
Ser16 Ser25 Ser38 Ser63
Punto di collegamento dove le chinasi del ciclo
cellulare e quelle regolate da recettori
convergono a regolare le funzioni cellulari
25
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
La fosforilazione della statmina regola le diverse fasi
del ciclo cellulare
CHINASI
16 25 38 63
16 25 38 63
STATMINA
STATMINA
25 38
STATMINA
FUSO
MITOTICO
G2
M
S
FOSFATASI
STATMINA
G1
CHINASI
25 38
STATMINA
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
STATMINA => MIGRAZIONE
C’è e qual è il pattern di fosforilazione di
statmina che regola la migrazione
APPROCCIO FUNZIONALE IN VITRO
MUTAGENESI IN VITRO SITO SPECIFICA
26
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
SOSTITUZIONE DELLE SERINE CON ACIDO
GLUTAMMICO
Ser16 Ser25 Ser38 Ser63
Glu Ser25 Ser38 Ser63
PSEUDOFOSFORILAZIONE
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
SerSer-16 E
SerSer-25 E
SerSer-38 E
SerSer-63 E
Ser 1616-63 E
Ser 2525-38 E
Ser 1616-2525-3838-63 E
controllo: STMN+
Linea cellulare GNGN-11
27
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
• modificazione del livello di
espressione di statmina fosforilata
• analisi della proliferazione
• analisi della migrazione
• saggi di chemotassi (HGF/SF)
PROLIFERAZIONE
3,500
*
3,000
*
Ser 16-25-38-63 E
O.D.
2,500
2,000
1,500
*
1,000
0,500
0,000
1
2
3
GIORNI IN COLTURA
4
5
Ser-16 E
Ser-25 E
Ser-38 E
Ser-63 E
Ser 16-63 E
Ser 25-38 E
Ser 16-25 E
Ser 38-63 E
STMN+
I risultati di proliferazione sono coerenti coi dati
presenti in letteratura
28
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
MIGRAZIONE
Metodo TRANSWELL: motilità basale
saggi di chemiotassi
PARADIGMA SPERIMENTALE: HGF/SF come stimolo
(Giacobini et al., 2002)
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
16
25
38
63
16-63
25-38 16-25-38-63 STMN+
PROLIFERAZIONE
=
=
=
=
=
=
++++
+
MIGRAZIONE SFM
-
=
=
-
-
-
--
+
MIGRAZIONE HGF
++
--
++
-
-
-
--
+
La fosforilazione della statmina INIBISCE la
migrazione delle GN-11
Il pattern di fosforilazione che regola la migrazione
NON è quello che regola la proliferazione!!!
29
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
STIMOLO (HGF/SF)
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
ATTIVAZIONE DI CHINASI
EFFETTO BIOLOGICO (MIGRAZIONE)
??
Migrazione: CHINASIó
CHINASIóFOSFATASI
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
INIBIZIONE DELLE SERINE FOSFATASI
MEDIA
GN-11
cells
1600
*
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
SFM
HGF
SFM+NaF
HGF+NaF
30
2. REGOLAZIONE DELLA STATMINA
E MIGRAZIONE
SFM
1200
HGF/SF
1000
800
*
600
400
*
*
*
200
*
0
0
16
25
2
38
63
4
16-63
6 25-38 8
4mut 10 ctrl
12
Su alcuni mutanti l’HGF non ha effetto….
CONCLUSIONI
In situ la statmina è espressa dai neuroni
GnRH SOLO durante la migrazione
Modificazioni dell’espressione di statmina in
vitro confermano un ruolo attivo nella
migrazione delle cellule GNGN-11
La variazione di statmina agisce sulla motilità
cellulare a livello generale e non modifica la
capacità delle GNGN-11 di aumentare la
migrazione in risposta all’HGF
31
La proliferazione delle GNGN-11 è incrementata da
AUMENTO e FOSFORILAZIONE della statmina
La fosforilazione della statmina inibisce la
motilità cellulare e MODIFICA la capacità
delle GNGN-11 di rispondere allo stimolo
dell’HGF/SF
Il quadro di fosforilazione che regola la migrazione NON è
lo stesso che regola il ciclo cellulare.
PROLIFERAZIONE: attivazione sequenziale di
chinasi e fosfatasi
MIGRAZIONE: attivazione contemporanea di
chinasi e fosfatasi che agiscono su serine
diverse
32