Salvatore Tripodi
Allergologia Pediatrica
Ospedale “Sandro Pertini”
La biologia molecolare applicata
all’immunoterapia specifica
[email protected]
Skin Prick Tests
“Dottore, mio figlio è allergico a tutto!?!”
Fonte
Produttore
di allergene allergenica
Molecola
allergenica
Der p 1
Ghiandole
salivari
e cutanee
Ghiandole
salivari
e cute
Fel d 1
Can f 1
Nomenclatura delle molecole allergeniche
Phleum pratense 1
r = ricombinante
n = nativo
s = sintetico
rPhl p 1
Prime 3 lettere
del Genere
Prima lettera
della Specie
ordine di
identificazione
Dermatophagoides pteronyssinus 1.0106
r = ricombinante
n = nativo
s = sintetico
Prime 3 lettere
del Genere
Der p 1.0101
Prima lettera
della Specie
Der p 1.0123
ordine di
identificazione
isoforme
a. Peso molecolare simile
b. Identica funzione biologica, se nota, per es. attività enzimatica
c. > 67% di identità di sequenza amminoacidica.
allergeni
specifici
allergeni
cross-reattivi
Componenti Allergeniche
specifiche e crosscross-reattive
sensibilizzanti
primari
panallergeni
Marco
8 years, from Verona
sneezing, rhinorrhea, itching nose and eyes
from March to September,
worse with wind and outdoor
J FMAM J J A SOND
SPT > 3 mm : birch, grass, mugwort
would you prescribe specific immunotherapy?
MANY WOULD ANSWER
NO
La stagione complessiva dei pollini,
e quindi delle pollinosi, tende ad
essere più lunga per:
•anticipo della fioritura di piante
invernali e primaverili;
•prolungamento della stagione
per alcune “erbe” a fine estateinizio autunno.
Frenguelli 04
Frenguelli et al, An.All.Asthma Immunol. 2010.
La fenologia vegetale in particolare si
occupa della definizione delle fasi di
sviluppo (o fasi fenologiche) delle piante
in particolari scale fenologiche e della
registrazione delle date in cui esse si
verificano nei diversi ambienti.
Your daughter is allergic to grass!
what does it mean?
mix
phl p 1
timothy grass
pollen grains
Phl p 1
Phl p 2
Phl p 3
Phl p 4
Phl p 5
Phl p 6
Phl p 7
Phl p 11
Phl p 12
Allergens in a pollen grain
(es. Phleum pratense“
(Timothy grass, Coda di Topo“
specific
highly
cross-reactive
Phl p 1
Phl p 2
Phl p 3
Phl p 4
Phl p 5
Phl p 6
Phl p 7
Phl p 12
timothy
in many other pollens
and vegetables
birch
timothy
mugwort
Allergens in a pollen grain
(es. Phleum pratense“
(Timothy grass, Coda di Topo“
grass pollen
Lolium
Phleum
specific
polcalcin
cross-reactive
profilin
Birch
Bet v 1
Mugwort
Art v 1
Phl p 1
Phl p 2
Phl p 3
Phl p 4
Phl p 5
Phl p 6
Lol p 1
Lol p 2
Lol p 3
Lol p 4
Lol p 5
Lol p 6
Phl p 7
Lol p 7
Bet v 4
Art v 5
Phl p 12
Lol p 12
Bet v 2
Art v 4
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Bet v 1
Phl p 4
Phl p 6
Phl p 7
Bet v 4
Phl p 12
Bet v 2
timothy grass
birch
Art v 5
Art v 4
Art v 1
mugwort
mugwort
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 6
Bet v 1
Phl p 4
Grass
polcalcin
Phl p 7
polcalcin
Bet v 4
Phl p 12
profilin
profilin
Bet v 2
polcalcin
Art v 5
profilin
Art v 4
molecular
diagnosis
with IgE
Mugwort
Art v 1
Birch
2010
2009
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 6
Phl p 4
Grass
Grass
polcalcin
CBP
profilin
profilin
profilin
Birch
CBP
profilin
mugwort
Mugwort
birch
grass
ctr negative
histamine
SPT with extracts
apparently similar patients (with extracts“
have totally different patterns of sensitization
mugwort
birch
grass
ctr negative
histamine
SPT with extracts
#1 - true polysensitised child
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 6
Bet v 1
Phl p 4
Grass
molecular
diagnosis
with IgE
Birch
mugwort
Mugwort
birch
grass
ctr negative
Art v 1
histamine
SPT with extracts
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 6
Phl p 4
Grass
Phl p 7
Birch
Phl p 12
#2
false polysensitised
monosensitised
to grass pollen
Mugwort
molecular
diagnosis
with IgE
mugwort
birch
grass
ctr negative
histamine
SPT with extracts
#3
false polysensitised
monosensitised
to birch pollen
Bet v 1
Grass
Bet v 4
Birch
Bet v 2
Mugwort
molecular
diagnosis
with IgE
mugwort
birch
grass
ctr negative
histamine
SPT with extracts
#4 - false polysensitised = monosensitised to mugwort
Grass
Birch
Art v 5
Art v 4
molecular
diagnosis
with IgE
mugwort
Mugwort
birch
grass
ctr negative
Art v 1
histamine
SPT with extracts
#5 - true polysensitised child + panallergens
Phl p 2
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 6
Bet v 1
Phl p 4
Grass
Phl p 7
Bet v 4
Phl p 12
Bet v 2
Birch
Art v 5
Art v 4
molecular
diagnosis
with IgE
mugwort
Mugwort
birch
grass
ctr negative
Art v 1
histamine
SPT with extracts
Conventional Diagnosis based upon allergenic extracts
1
2
anamnesis
physical examination
tentative diagnosis
conventional allergy test (SPT, IgE-Ab)
vaccine
3
IgE-Ab at molecular
Marco
Birch, Grass, Mugwort
level
drugs
NO (?)
YES
Laura
Birch, Grass, Mugwort
NO (?)
YES
Anna
Birch, Grass, Mugwort
NO (?)
YES
YES
YES
Pino
singleplex
Grass
multiplex
which allergenic molecules should I test for IgE reactivity?
(simplified example“
panallergens
Polcalcins
profilins
specific molecules
extract
Phl p 1; Phl p 5
grass
Phl p 7
Phl p 12
Bet v 1
birch
Bet v 4
Bet v 2
Art v 1
mugwort
Art v 5
Art v 4
Schema delle molecole allergeniche primarie e cross-reattive
Algoritmo per la diagnosi molecolare nei pazienti polisensibili a pollini
IgE Molecolari per markers primari
allergeni specifici
A
B
c
(es. Phl p 1)
(es. Ole e 1)
(es. …)
POSITIVE
IgE Molecolari per molecole
cross-reattive
CO-SENSIBILIZZAZIONE
Profilline
Polcalcine
(es. Bet v 2)
(es. Phl p 7)
NEGATIVE
ITS per sensibilizzante/i
primario/i
NEGATIVE
POSITIVE
CO-RICONOSCIMENTO
Individuare Markers di
sensibilizzazione primaria
POSITIVE
Marco
8 years, from Verona
sneezing, rhinorrhea, itching nose and eyes
from March to October,
worse with wind and outdoor
J FMAM J J A SOND
SPT > 3 mm : birch, grass, mugwort
IgE to molecules?
Phl p 1; Phl p 5
grass
Phl p 7
Phl p 12
Bet v 1
birch
Bet v 4
Bet v 2
Art v 1
mugwort
Art v 5
Art v 4
would you prescribe specific immunotherapy?
MANY WOULD ANSWER
YES
NO
grass
La rete II-Pan
e lo studio
Panallergeni in Pediatria
“RICERCARE INSIEME PER CURARE MEGLIO”
G. Marseglia
Ascoli Piceno
A. Bianchi
Crotone
F. Paravati
PANALLERGENS IN PAEDIATRICS
recruitment
& follow-up
MI1
MI2
TS
GE
FI
RA
RM1
PD
RM3 RM4
sera
Bio-bank
BN
NA
BA
CZ
RM
clinical data
TPS
Italian @llergy.CARD
IgE
data
Allergy Lab. (PD)
PD
Databank – Statistics
wp1
profilin, CBP
& pollinosis
wp2
LTP syndrome
wp3
allergy to mites
& tropomyosins
IgE
Domande e Obiettivi dello Studio
Panallergeni in Pediatria
• Le molecole sono collegate alla gravità clinica?
• Le molecole sono utili nella scelta del vaccino basato
sull’utilizzo di estratti?
• Le molecole sono utili ad orientare la CRT?
• Il monitoraggio è utile alla diagnosi?
study time-line
in progress
planned (?“
IgE panallergens
negative
recruitment
& IgE test
clinical evolution
ITS
efficacy
ITS
efficacy
12 mo.
positive
clinical evolution
IgE panallergens
1700 patients
Age 4-18y
30-3-2011
arruolati 1086 bambini
PANALLERGENS IN PAEDIATRICS
Pilot study:
May September 2009
Only centres in Rome
200 patients recruited
Target: warming-up, test procedures
identify weak points in the protocol
Preliminary results?
Cartella Allergo-Pneumologica
e Test in vivo
•
•
•
•
•
•
•
300 campi/dati per paziente
Consenso Informato
Scheda anagrafica
Anamnesi Familiare
Anamnesi Patologica
Risultati Skin Prick Test
Coordinate posizione siero
all’interno della sieroteca
• Campionamento del paziente
nel sottoprogetto di pertinenza
the telematic platform of the Italian Paediatric Allergy Network
Cartella Allergo-Pneumologica:
Parametri studiati
• Criteri gravità
rinocongiuntivite “ARIA”
• Criteri gravità asma “GINA”
Diario clinico telematico
• Accesso mediante pwd
personale
• Grafica semplificata e
interattiva
• Anamnesi patologia prossima
(Rinocongiuntivite, Asma)
• Anamnesi Farmacologica
• Calcolo indici derivati (RTSS)
tripodi
*****
•
•
prurito oculare
lacrimazione
•
•
•
•
starnuti
secrezione nasale
prurito nasale
ostruzione
score: 0-18
Curve sintomatologiche ottenute mediante
modello statistico di interpolazione dei dati
Test in vitro
• IgE totali
• IgE specifiche contro:
allergeni estrattivi
singole molecole
Cynodon dactylon
nCyn d 1
Phleum pratense
Phl p 1
Phl p 2
Phl p 4
Phl p 5b
Phl p 6
Phl p 7
Ph p 11
Phl p 12
Betula verrucosa
Bet v 1
Bet v 2
Bet v 4
Olea europaea
Ole e 1
Cupressus arizonica
Platanus acerifolia
Artemisia vulgaris
Art v 1
Ambrosia elatior
Parietaria judaica
Par j 2
Plantago lanceolata
Pru p 3
IgEs UniCAP
estratti
sensibilizzanti primari
panallergeni
Distribuzione di frequenza delle singole
molecole phl in soggetti positivi all’estratto
90
80
70
prevalence (%)
60
50
40
30
20
10
0
Phl p 1
Phl p 2
Phl p 4
Phl p 5
Phl p 6
Phl p 7
Phl p 11
Phl p 12
No influence of age?
Sensitization to panallergens (IgE>1kU/l)
percent
30
27.3%
26.8%
28.2%
26.2%
31.6%
Phl pp11
7 (1.5%)
(1.5%)
Phl p 12 (12.1%)
Pru p 3 (15.3%)
20
10
0
4 to 6
7 to 9
10 to 12
13 to 15
age (years)
16 to 18
any
Influenza del pattern molecolare
sulla severità dei sintomi
Molecole vs ARIA
intermittente-lieve
intermittente-mod./severa
persistente-lieve
persistente-mod./severa
Relazione tra numero di molecole di Phl p riconosciute
e concentrazione media di IgE contro Phl p
1000,00
IgE contro Phleum pratensis (kU/l)
100,00
10,00
1,00
0,10
0,01
0
1
2
3
4
5
numero di molecole
6
7
8
9
Ruolo clinico dei livelli di IgE specifiche contro il Phleum pratense
1,50
1,45
1,40
SMS medio
1,35
1,30
1,25
SMS
1,20
1,15
1,10
1,05
1,00
<17,5
tra 17,5 e 100
IgE ccontro Phl p (kU/l)
>100
Phl p5b Pat
1
Phl p5b 48,7%
30 different patterns
of IgE sensitization
Phl p1to Phleum 7%
pratense (!!!“
>0.35kU/l
Phleum pratensis molecules recognized (Phl p X)
1
2
4
5b
6
7
11
12
N
●
●
36
%
25,5
20
14,2
13
9,2
10
7,1
9
6,4
8
5,7
6
4,3
5
3,5
4
2,8
4
2,8
4
2,8
3
2,1
3
2,1
3
2,1
2
1,4
2
1,4
2
1,4
1
0,7
1
0,7
1
0,7
1
0,7
●
1
0,7
●
1
0,7
●
1
0,7
2
●
●
●
3
●
●
●
4
●
●
●
●
5
●
●
●
●
6
●
●
●
●
●
●
7
●
●
●
●
●
●
8
●
9
●
●
●
10
●
●
●
●
11
●
●
●
●
12
●
●
●
●
13
●
●
14
●
●
●
●
●
16
17
●
●
●
●
15
Phl p5b Different patients,Phl
all sentized
p1 to- Timothy grass,
present different molecular sensitization patterns
4,2%
Phl p1 -
●
●
●
●
●
●
●
18
●
●
●
●
19
●
●
20
●
●
21
●
●
●
●
●
22
23
●
●
●
24
●
●
●
●
●
●
●
●
141 100,0
Heiss S. et al. J Invest Dermatol 1999
How many “Marco”?
Birch
panallergens
EXTR
#1 45,81
#2 36,17
#3 29,72
#4 27,14
#5 25,62
#6 15,50
#7 11,15
9,64
#8
6,73
#9
6,57
#10
5,22
#11
4,40
#12
4,11
#13
2,02
#14
0,88
#15
#16
0,74
0,60
#17
Bet v 1
22,96
0,27
0,04
25,89
22,85
15,75
13,61
2,93
0,11
8,35
0,03
0,04
2,69
2,16
0,07
0,06
0,47
Bet v 2
0,10
35,33
0,10
0,04
0,34
0,02
0,03
17,40
7,04
0,01
7,20
4,44
1,78
0,01
1,36
0,03
0,01
Bet v 4
0,08
0,11
57,77
0,03
0,40
0,02
0,02
0,05
0,06
0,01
0,01
0,02
0,01
0,01
0,02
2,02
0,01
A) true sensitization to birch
B) sensitization to birch and to profilin
C) sensitization to profilin
D) sensitization to polcalcin
Birch
Timothy grass
panallergens
EXTR
#1 45,81
#2 36,17
#3 29,72
#4 27,14
#5 25,62
#6 15,50
#7 11,15
9,64
#8
6,73
#9
6,57
#10
5,22
#11
4,40
#12
4,11
#13
2,02
#14
0,88
#15
#16
0,74
0,60
#17
Bet v 1
22,96
0,27
0,04
25,89
22,85
15,75
13,61
2,93
0,11
8,35
0,03
0,04
2,69
2,16
0,07
0,06
0,47
Bet v 2
0,10
35,33
0,10
0,04
0,34
0,02
0,03
17,40
7,04
0,01
7,20
4,44
1,78
0,01
1,36
0,03
0,01
Bet v 4
EXTR
Phl p 1
0,08
0,11
152,99 167,66
57,77
98,56
49,47
0,03
0,40
0,02
nel0,02
41% dei casi
diagnosi
0,05 errata di
0,06
155,56 151,79
sensibilizzazione
0,01
a betulla92,60
!
0,01
73,27
0,02
61,42
62,38
0,01
0,01
0,02
24,56
16,61
2,02
41,39
29,33
0,01
in this small serie we found seven „Marco“
panallergens
Phl p 12
Phl p 7
27,04
0,05
0,08
67,73
9,06
0,09
4,21
2,08
0,02
0,02
4,39
0,04
0,04
3,15
2004; 101: 14677-82.
J Allergy Clin Immunol 2005; 116: 608 – 13.
Clinical and Experimental Allergy, 2008; 38, 1514-1525
Immunotherapy with recombinant
grass pollen (Phleum) allergens
•
•
Double-blind placebo-controlled trial (24 active; 25 placebo)
January 2002 to August 2003
Phl p 6
5µg
Phl p 5b
10µg
Phl p 1
10µg
5µg
10µg
Phl p 2
Phl p 5a
Jutel et al, JACI 2005
Immunotherapy with recombinant grass allergens
Well-days
42
A
P = 0.015
P
Medication
A
P = 0.660
P
Combined SMS
A
∆ = 38.9%
P
0
10
P = 0.044
20
Score
Jutel et al, JACI 2005
active (n=24);
Days without symptoms
Symptoms
35
p=0.025
28
21
14
7
30
0
A
placebo (n=25)
P
Phl p 5a/b specific
antibody responses
107
106
IgG4 ( ng/ml )
105
Four Phl p 5 IgE-negative
subjects treated with a
cocktail containing Phl p 5a/b
104
103
103
137
154
156
102
101
1,4
103
137
154
156
1,2
106
1
2
3
4
5
0,8
0,6
0,4
0,2
104
103
103
137
154
156
102
101
1
2
3
4
blood sample
5
6
105
1,0
IgG1 ( ng/ml )
IgE ( kUa/l )
100
6
100
1
2
3
4
5
6
Jutel et al, JACI 2005
Pattern phl a 8-6-4 molecole
Phl p 1,2,4,5b,6,7,11,12
bin
160
248
224
184
249
250
186
251
128
0
32
185
225
240
96
162
48
176
187
188
2
16
34
58
161
164
226
232
254
255
pattern 0,35
10100000
11111000
11100000
10111000
11111001
11111010
10111010
11111011
10000000
00000000
00100000
10111001
11100001
11110000
01100000
10100010
00110000
10110000
10111011
10111100
00000010
00010000
00100010
00111010
10100001
10100100
11100010
11101000
11111110
11111111
pz 0,35
41
29
15
13
9
9
8
8
7
5
4
4
4
4
3
3
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
n 8 (0,35)
2
5
3
4
6
6
5
7
1
0
1
5
4
4
2
3
2
3
6
5
1
1
2
4
3
3
4
4
7
8
Phl p 1,2,5b,6,11,12
Phl p 1,2,5b,6
bin
32
pattern 0,35
100000
pz 0,35
49
n 6b (0,35)
1
bin
pattern 0,35
pz 0,35
n All (0,35)
15
1111
57
4
60
111100
29
4
8
1000
53
1
44
101100
15
3
48
110000
15
2
11
1011
29
3
62
111110
10
5
12
1100
21
2
0
000000
9
0
0
0000
11
0
61
111101
9
5
14
1110
4
3
63
111111
9
6
2
0010
3
1
46
101110
8
4
4
0100
3
1
45
101101
4
4
10
1010
2
2
49
110001
4
3
3
0011
1
2
56
111000
4
3
13
1101
1
3
8
001000
3
1
16
010000
3
1
34
100010
3
2
2
000010
2
1
40
101000
2
2
47
101111
2
5
14
001110
1
3
33
100001
1
2
50
110010
1
3
52
110100
1
3
IgEs x una data molecola:
1= presenti
0= assenti
Pattern phl a 8-6-4 molecole: 75% del
campione
IgEs x una data molecola:
1= presenti
0= assenti
Phl p 1,2,4,5b,6,7,11,12
Pattern a 8 molecole:
9 pattern coprono il
75% del campione
Phl p 1,2,5b,6,11,12
Pattern a 6 molecole:
7 pattern coprono il
75% del campione
Phl p 1,2,5b,6
Pattern a 4 molecole: 3
pattern coprono il 75%
del campione
Trial con vaccino molecolare (CRT)
Phl p 6
5µg
Phl p 5b
10µg
Phl p 1
10µg
5µg
10µg
Phl p 5a
Phl p 2
Quanti pazienti coperti da un vaccino molecolare?
(phl p 1,2,5b,6)
Monitoraggio Aerobiologico
Grazie alla preziosa
collaborazione di
Alessandro Travaglini
(AIA)
• PRIMA: Previsioni
Aerobiologiche del periodo di
picco pollinico durante il
quale condurre il
monitoraggio dei sintomi
clinici
• DURANTE: Determinazione
istantanea delle
concentrazioni di granuli
pollinici e identificazione dei
reali picchi pollinici sul
territorio romano
4,09
9,34
12,70
9,35
0,24
5,13
0,00
nCyn d 1 (allergene primario del G2)
Phleum pratense (estratto)
Ph p 1 (allergene primario del G6)
Ph p 4 (allergene primario del G6)
Ph p 12 (profilina, panallergene del G6)
Parietaria judaica (estratto)
Par j 2 (allergene primario del W21)
300
Giordano, Gram + & Parietaria +
8
7
250
200
5
150
4
3
100
2
50
1
0
0
15/5 17/5 19/5 21/5 23/5 25/5 27/5 29/5 31/5
2/6
4/6
6/6
8/6
10/6 12/6 14/6 16/6 18/6 20/6 22/6 24/6
Graminae
Urticacee
RTSS
7 Per. Media Mobile (Graminae)
7 Per. Media Mobile (Urticacee)
7 Per. Media Mobile (RTSS)
RTSS
medias pollini/m3
6
CONCLUSIONI
L‘Allergia Molecolare non è il futuro, ma il presente e….
1. … può facilmente essere effettuata con i nuovi metodi diagnostici
2. … è utile per identificare le sensibilizzazione primarie
3.
nei bambini polisensibili
4. … può modificare la nostra decisione clinica in relazione alla
immunoterapia allergene specifica, quando indicata
Il diario clinico on line (AllergyMonitor®) integrato con la conta
pollinica può rappresentare uno strumento formidabile per seguire
meglio la patologia allergica e per individuare l‘allergene/i principali
nei pazienti polisensibili
La rete I-P@N è un importante strumento per svolgere studi in ambito
allergologico-pediatrico
[email protected]