"La qualità alimentare.
La relazione tra
alimentazione salute e ambiente
"
ENEA - Casaccia
13 Maggio, 2004
‘La Diagnostica
Biomolecolare’
Eugenio Benvenuto
LA DIAGNOSTICA BIOMOLECOLARE
‘Definizione’:
La diagnostica di biomolecole (principalmente
acidi nucleici e proteine) utilizzando
metodiche avanzate di biologia molecolare,
biochimica ed immunologia.
Metodi convenzionali per la diagnostica
alimentare (di tipo microbiologico)
• Isolamento e conta di cellule batteriche vitali su specifici
mezzi di coltura
• Saggi fisico-chimici (misura di cambi nel mezzo di coltura
provocati dalla crescita o dal metabolismo batterico) :
- Cambio della conduttivita’ in mezzo di coltura
( es. Bactometer bioMérieux)
- Bioluminescenza e fluorescenza
• Saggi biochimici miniaturizzati
(es. Enterotube II -Becton Dickinson-, Enterobacteriace II -Becton
Dickinson-, Micro-ID Listeria -Organon-)
Metodi convenzionali per la diagnostica
alimentare
• BIOLOG identification system, Capacita’ di metabolizzare
un panel di 95 differenti fonti di carbonio
• Saggi immunologici, basati sulla reazione antigeneanticorpo utilizzati per l’identificazione e la subtipizzazione
batterica
- Saggi di Immunofluorescenza
- Saggi ELISA
•
Test basati sugli acidi nucleici
- Sonde di DNA (Ibridazione)
- Saggi di amplificazione PCR
Necessita’ di metodiche sempre piu’ rapide,
precise e che abbraccino in maniera parallela
piu’ analiti
_
N° di campioni, analiti e precisione
+
Tempo
COMPLETELY SEQUENCED GENOMES
Viruses
Archea
Bacteria
Yeasts
1286
18
155
[3] Schizosaccharomyces pombe , [16]
Saccharomyces cerevisiae
2
Nematoda [ 6] Caenorhabditis elegans
Algae
[ 3] Guillardia theta nucleomorph genome
1
1
Plasmodia [14] Plasmodium falciparum
Fungi
[11] Encephalitozoon cuniculi genome
Mammals [24] Homo sapiens , [21] Mus musculus , [12]
Rattus norvegicus (rat)
Insects
[ 5] Anopheles gambiae, [ 5] Drosophila
1
1
3
2
melanogaster
Plants
[ 5] Arabidopsis thaliana
[x] Chromosome number
1
Fonte: NCBI, 2004
Le parole chiave della genomica che vanno
incontro alle esigenze della diagnostica
molecolare sono:
• Alta processivita’ (high throughput)
• Metodologie di analisi parallela su larga scala
Metodi innovativi per la diagnostica alimentare
Basati su:
• amplificazione del DNA mediante PCR o ‘RealTime’ PCR
• anticorpi ricombinanti (Librerie di anticorpi
sintetici in formato di ‘single chain Fv’ )
• tecnologie ‘Microarray’
- DNA chips
- Protein chips
Vantaggi della ‘Polymerase chain
reaction’ PCR
• Estremamente sensibile e precisa
• Estremamente rapida (poche ore)
• Puo’ essere utilizzata per rilevare
microrganismi difficili da coltivare in
laboratorio o estremamente pericolosi
Analisi quantitativa in ‘REAL TIME’
• Ciclo termico molto rapido
• Termostatazione ad aria
• Mantenimento uniforme della
temperatura
all’interno
dei
capillari
•Tempi di esecuzione delle
analisi molto rapidi (30-40 cicli di
PCR vengono completati in 2030 minuti).
LightCycler® System
Fluorescence–based probes for Real Time PCR
FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Taqman®
EUREKA!
•
SAMPBABYFOOD
EUREKA PROJECT 2406
Sampling and methods of analysis
for the determination of DNA
“transgene” fragments in baby foods
PLADA NORD S.r.l. Istituto Superiore di
Plasmon
Sanità
Advantages of Microarrays
technology
• Miniaturized and parallel assay system
• Large scale and highthroughput biological
analysis
• Rapid
First molecular multi-detection test for food and feed analysis:
FoodExpert ID Test ®, bioMerieux -Affimetrix ® Genechip Technology®
• Based on high density DNA
chip which supports 80000
oligonucleotide DNA probes
(17 nucleotides long)
• Synthesized on the surface
of the chip by photolithography
• Probes complementary to
specificregions of vertebrate
Cytochrome b gene
• Can identify 3 classe of vertebrates, mammals fishes and birds
and 33 species of animals, regardless of whether the food is
raw or processed.
• Sensitivity: 0.01% of the total weight, validated at 5% w/w
FoodExpert ID Test ®, Test principle
High density DNA chip, GeneChip®
Extraction
of DNA
and PCR
Transcription
and labeling
Hybridization on
the chip
Scan
Several examples:
•Absence of animal by-products in livestock feed
•Verification of absence of animal food for vegetarians…..
Un sistema 'immunitario' sintetico
per la produzione di reagenti specifici
ad alta stabilità
BIOTEC GEN
Anticorpi come reagenti
Capacità di legare un antigene
con alta affinità e specificità
APPLICAZIONI
Coniugazione con
isotopi radioattivi o
molecole citotossiche
Identificazione di
marcatori
in vivo o in vitro
diagnostica
terapia
ricerca
• Cromatografia
• Immunoprecipitazione
• Cristallografia
• Immunolocalizzazione
• Immunomodulazione
• Proteomica
Tecnologia
dell’ibridoma
 Alti costi
A hybridoma secretes monoclonal
antibodies
 Infrastrutture appropriate
 Lunghi tempi di lavoro
 Problemi etici
Anticorpi ricombinanti
Fv
Fd
VH
VL
CL
-S-S-
Fab
CH1
-S-S-S-S--S-S--
CH2
CH3
-S-S-
-S-S-
-S-S-
F(ab’)2
CDRs
-S-S-
scFv
NotI
NcoI
CDR1
CDR2
VH
CDR3
CDR1
CDR2
CDR3
VL
PCR
PCR
lacZ
scFv
amber
PelB
pIII
g3p
Diversità: 5 x 107
M13 Phage Particle
scFv gene
Genotype
Protein chip based technology
Sera+Antibodies
Antigen-Antibody
Antibody chip
Antibodies
Antigen-Antibody
Antigen chip
Protein-Protein
Protein-Liposome
Protein Chip
Protein-Drug
Enzyme-Substrate
Antigen Chip-based allergy diagnosis
A multi-allergen test system based on microarrayed recombinant
allergens for component-resolved allergy diagnosis.
(A) A standard calibration curve of purified human IgE and recombinant tree pollen allergens
(Bet v 1, Bet v 1m, Bet v 1a, Bet v 2, Aln g 1, and Cor a 1), recombinant food allergens (Dau c
1, Mal d 1, and Api g 1), recombinant grass pollen allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6,
and Phl p 7), recombinant mould allergens (Alt a 1 and Alt a 2), and recombinant latex
allergens (Hew b 3, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, and Hev b 10) were spotted
in triplicates on the allergen chip. GD: guideline dots for scanning. (B) Image of a pollenallergic patient with IgE reactivity to rBet v 1, r Aln g 1, rCor a 1, rPhl p 2, and rPhl p 5. (C)
Image of a non-allergic individual (control).
Science (2002), Vol. 295
Prospettive Future
Nanobiotecnologie, le tecnologie che si basano sulla manipolazione di
biomateriali per costruire dispositivi diagnostici delle dimensioni di
un miliardesimo di metro
• 100 volte piu sensibili delle
tecniche diagnostiche
convenzionali
• Maggiore semplicita’ di analisi
• Non necessitano di alcuna
reazione di amplificazione di
PCR, riducendo ulteriormente
tempi
• Previsione di dispositivi 1000
volte piu’ economici degli attuali