Il percorso diagnostico in allergologia
Diagnosi
Sintomo
Diagnosi
Sintomo
Il percorso diagnostico in allergologia
L’Iter diagnostico si fonda su:
 Anamnesi;
 Esame obiettivo;
 Indagini allergologiche
Anamnesi
Una anamnesi corretta permette da sola :

di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ;

ha una specificità che sfiora il 95% ;

consente di individuare la presenza di comorbidità
Esame Obiettivo:
 Non presenta caratteristiche peculiari,
 Può essere negativo per la caratteristica accessionalità
delle sindromi allergiche (utile esaminare il paziente in
fase acuta e in fase intervallare, per confrontare i reperti
osservati);
Indagini Allergologiche :
•
Test in vivo
Prick test
Intradermoreazioni
Patch test
Test di provocazione
•
Test in vitro
Dosaggio IgE sieriche
Dosaggio mediatori
Principi diagnostici delle malattie IgE-mediate
Cute
Sangue
Test Cutanei
Dosaggio delle
IgE specifiche nel siero
Rilascio istamina
Attivazione
basofili
Challenge specifico nasale,
Mucosa
bronchiale, congiuntivale, orale
Conta Eosinofili
Indagini allergologiche in vivo
Prick test
Test intradermico
Prick test alimenti
Patch test
TPO
Prick test e allergia respiratoria
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
Prick test e allergia alimentare
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
• TPO
TEST IN VITRO
• Determinazione IgE totali e specifiche verso estratti e verso singole
moleole
• Determinazione di anticorpi non-IgE verso allergeni
• Dosaggio di mediatori chimici flogogeni
• Dosaggio di immunocomplessi
• Dosaggio di frazioni complementari
• Eosinofili su secreto nasale
Determinazione delle IgE
 IgE Totali
 IgE Specifiche
Le IgE totali costituiscono lo 0,004% di tutte
le immunoglobuline.
Dosaggio delle IgEs
IgE Specifiche verso estratti
IgE Specifiche verso singole molecole
TERMINOLOGIA
• Fonte
allergenica
• Estratto allergenico
• Allergene
• Isoallergene
• Epitopo
FONTE ALLERGENICA
Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la
parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche,
non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento.
ESTRATTI ALLERGENICI
Gli estratti allergenici comunemente impiegati per
la diagnostica in vivo (Ptick test) e in vitro
(RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche
(polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.).
Caratteristiche degli Estatti Allergenici:
Gli Estratti Allergenici Grezzi contengono:
 gli allergeni responsabili della sensibilizzazione,
 altre sostanze e proteine
 il Materiale Grezzo viene
sottoposto a processo
estrattivo della componente
proteica,
La Componente Proteica
viene trattata per individuare
le sostanze con potere
antigenico (mappa antigenica
dell’ estratto),non tutte fornite
di potere allergenico
 L’Estratto Antigenico viene
sottoposto a processo di
tipizzazione degli allergeni
facendolo reagire con il
siero di pazienti contenenti
le IgE specifiche.
 Ciascun soggetto allergico
possiede infatti un proprio
caratteristico Assetto
Allergenico per la presenza
di IgE specifiche rivolte
verso l’uno o l’altro
componente allergenico
dell’estratto.
ALLERGENI
Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apteni
coniugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e
150 kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10
ISOALLERGENI
Indicano forme molecolari multiple dello stesso allergene
proveniente dallo stesso organismo con un’estesa, ma non
obbligatoria, cross-reattività.
Hanno in genere un peso molecolare molto simile, la stessa
struttura terziaria e la stessa funzione biologica e hanno
almeno il 67% d’identità nella sequenza aminoacidica.
Ad esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni con
identità di sequenza tra il 73 e il 98%.
Isoallergeni
Xxx y1
Xxx y1.01
EPITOPI
Gli Epitopi sono la porzione di allergene effettivamente
riconosciuta e legata da un anticorpo specifico
Ciascun allergene può presentare un numero elevato di epitopi
pertanto ad es. non esistono IgE specifiche per latte (fonte
allergenica) o per caseina (allergene del latte) ma IgE
specifiche dirette verso gli epitopi della caseina.
Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali
EPITOPO Lineare
Epitopi “lineari” (aminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla
struttura primaria dell’allergene) solitamente termo- e gastroresistenti
EPITOPO Conformazionale
Epitopi “conformazionali” (aminoacidi non in sequenza, non
contigui, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della
catena proteica possono diventare contigui, la loro formazione
dipende quindi dalla struttura tridimensionale dell’allergene)
solitamente termo- e gastro- labili
Effetto della cottura e della digestione
sulle proteine alimentari
E
G
G
E
G
G
E
G
E
G
1
Processing
G
2
Sampson & Cooke. J Immunol 1997; 159:2026-2032.
G
CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE
ALLERGENICHE
Le molecole allergeniche si possono ulteriormente
classificare in:
-“GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es.
Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline
dell’olivo e delle altre Oleaceae)
- “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti
allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate,
responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti
con estratti
Dalla Fonte allergenica alle molecole
Genuine Panallergeni
Dosaggio delle IgEs
IgE Specifiche vs estratti
RAST
Dosaggio delle IgEs
Si può eseguire, in casi di dubbi, dopo aver effettuato i prick test, per
ottenere conferma diagnostica
Possono essere eseguite, al posto dei test cutanei, quando
questi risultino poco affidabili per:
 iporeattività cutanea legata a:
- età (primi anni di vita, età avanzata)
- farmaci (anti h-1, steroidi, ecc.)
- precedenti reazioni cutanee intensamente positive
 alterata reattività cutanea (ipo o iperreattività) legata a:
- malattia allergica in fase acuta e grave
- affezioni cutanee estese
-. dermografismo
Il Dosaggio delle IgE Specifiche va
attentamente e criticamente
valutato
 Il livello di IgE specifiche non è sempre
correlato con la gravità della sindrome clinica
 Il dosaggio di IgE specifiche ha sensibilità e
specificità inferiori rispetto ai test cutanei
 la positività delle IgE specifiche può non rivestire
significato eziologico nei confronti della malattia in atto (es.
Cross-reattività con alimenti vegetali, che si riscontra spesso nei
pollinosici, senza che vi sia alcuna manifestazione clinica dopo
ingestione di quegli alimenti).
Ricerca delle IgEs
IgE Specifiche verso singole molecole
CRD: Component Resolved Diagnosis
Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale
Con estratto di Pleum pratense
Prick test
con estratto
di Phleum
Diagnosi Allergologica in vitro tradizionale
Con estratto di Phleum pratense
Allergologia Molecolare
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
kUA /l
Phleum: proteine e allergeni
Immunoblotting di 12 paz. allergici al Phleum pratense
Pattern delle proteine e immunoblotting del siero di pazienti allergici
Estazione
Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale
Con estratto di Phleum pratense
Prick test
con estratto
di Phleum
Phl p1
+ - Phl p5
+
-
Phl p12
Phl p 7 +
+
-
Phleum pratense: proteine e allergeni
La fonte allergenica…
…contiene milioni di molecole….
…di cui solo alcune hanno
proprietà allergeniche
Che cosa è un allergene ricombinante?
Un allergene ricombinante è molecola allergenica prodotta con
tecniche di biotecnologia originariamente identificata da un estratto
allergenico. La maggior parte dei ricombinanti allergenici esistenti vengono
espressi in Escherichia coli e sono normalmente confrontabili con il loro
modello naturale(proteina) per quanto riguarda le caratteristiche
strutturali e le proprietà immunologiche.
Caratteristiche
Gli allergeni ricombinanti vengono prodotti senza che le proteine
subiscano variazioni genetiche, biologiche o di lotto.
Questo assicura l’ottenimento di allergeni di qualità costante ed
elevata standardizzazione
IUIS – Nomenclatura WHO
Phl p 1 .01
Genere
Specie
Cronologia
Isoallergeni
IDENTICHE FUNZIONI
BIOLOGICHE
PESO MOLECOLARE SIMILE
>67% IDENTITA’ DELLA
SEQUENZA AA.
Molecole Allergeniche: principali applicazioni
1. Miglioramento nel profilo diagnostico
2. Maggiori informazioni sulle poli-sensibilizzazioni (distinzione tra
co-sensibilizzazione e co-riconoscimento)
3. Valutazione della potenziale gravità di una reazione clinica (alcune
molecole allergeniche possono essere ”più pericolose” di altre)
4. Ruolo decisionale nell’ambito della ITS
5. Monitoraggio della risposta immunologica durante il trattamento …
Lidholm J et al. Component-resolved diagnostics in food allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6:234-40
Polisensibilizzazione
Cosensibilizzazione o Cross Reattività
Polisensibilizzazione
CO-SENSIBILIZZAZIONE:
presenza di IgE dirette verso epitopi distinti e unici presenti in fonti
allergeniche diverse (molecole allergeniche genuine)
CO-RICONOSCIMENTO (cross-reattività):
presenza di IgE verso molecole omologhe presenti in fonti
allergeniche diverse (panallergeni)
Asero R, 2010, mod.
Polisensibilizzazione
I “panallergeni” inalanti sono :
 Profiline
 CBP (Calcium binding protein o Polcalcine)
Asero R, 2010, mod.
Allergia Molecolare - Graminacee
Phleum pratense
90 %
85 %
Phl p1, Phl p5
CBP Phl p7
Genuine
Pollini, alberi, erbe,
graminacee
Phl p12 PROFILINA
La Diagnostica Molecolare nell’Allergia
respiratoria
Allergia Molecolare - Graminacee
Phleum pratense
90 %
85 %
Phl p1, Phl p5
Genuine
Allergia Molecolare - Graminacee
Phleum pratense
90 %
85 %
Phl p1, Phl p5
Genuine
Phl p12 PROFILINA
Allergia Molecolare - Graminacee
Phleum pratense
90 %
85 %
Phl p1, Phl p5
CBP Phl p7
Genuine
Pollini, alberi, erbe,
Phl p12 PROFILINA
Allergia Molecolare - Parietaria
Parietaria
83 %
Par j 3
Par j 2
Genuine
Par j 4
CBP
Pollini, alberi, erbe,
PROFILINA
Allergia Molecolare - Olivo
Olivo, (frassino, ligustro,forsitia)
< 30 %
Ole e 1
Genuine
Ole e 3, Ole e 8
Ole e 2
CBP
PROFILINA
Allergia Molercolare – Betulla
Betulla (fagales)
90 – 98 %
Bet v 1
Genuine
Allergia Molecolare - Betulla
Birch (fagales)
10 – 20 %
90 – 98 %
Genuine
Bet v 1
PROFILINA
Bet v 2
Bet v 4
CBP
Polleni, alberi,
graminacee, erbe
Pollini, alimenti
mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,
pomodoro, ontano, nocciolo, carpino
Alberi, graminacee, erbe, frutta, vegetali,
frutta con guscio, spezie, latice
Allergia Molecolare come procedere in pratica
A) IDENTIFICAZIONE DELLE FONTI ALLERGENICHE PRIMARIE
Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è
spesso clinicamente silente), SPT, IgE specifiche estratto
IgE specifiche per gli allergeni genuini specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art
v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1)
B) IDENTIFICAZIONE REATTIVITA’ A PANALLERGENI
IgE specifiche per panallergeni (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10)
SCELTA DELLA TERAPIA IDONEA
AM il razionale: Chi, Perchè e Quale vantaggio
1. Chi testare?
•
•
•
Pazienti con estratto allergenico completo positivo
Pazienti poli-sensibili (inalanti, alimenti)
Pazienti con pattern e sintomi respiratori non chiari
2. Perchè testare con AM? •
•
•
Fare una diagnosi differenziale
Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente
Migliore gestione del paziente
3. Quale vantaggio l’AM
comporta al clinico?
Definizione della ITS (o altra terapia)
Supporto nell’indicazione di eliminazione dell’allergene
Suggerimenti per le reazioni di cross-reattività
•
•
•
CRD e ITS
Selezione dei pazienti da avviare alla ITS
• Anamnesi
• Esame Obiettivo
• SPT o dosaggio IgEs basato
sugli estratti
Mugwort
Birch
Timothy
Si tratta di tre sensibilizzazioni genuine?
Mugwort
Birch
Timothy
..o di cross-reattività?
Mugwort
Birch
Timothy
Profilins and polcalcins may cause positive tests
La risposta è data dalla CRD
Mugwort
Birch
Timothy
Genuine sensitization to timothy only
Componenti genuine
Phl p 1
Phl p 5
Art v 1
Bet v 1
Indicazione
per ITS
Componenti cross-reative
Profilin
Polcalcin
Phl p 1
Phl p 5
Phl p 12
Phl p 7
Art v 1
Art v 4
Art v 5
Bet v 1
Bet v 2
Bet v 4
If only cross-reactive markes are identified
further investigation is needed
Allergia Molecolare: come procedere in pratica
Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19
La Diagnostica Molecolare nell’Allergia
Alimentare
Polisensibilizzazione
I “panallergeni“ alimentari sono :





Profiline (Bet v2 omologhe)
PR10 (Bet v1 omologhe)
LTP (Lipid Transfer Protein)
SSD (Seed Storage Protein)
CCD (Cross-reactive Carbohydrate Determinants)
Asero R, 2010, mod.
Risk assessment
Stabilità delle proteine
Proteine Labili
Reazioni locali
Proteine Stabili
Reazioni sistemiche
Allergia Molecolare – PR -10
Betulla (fagales)
Bet v 1
Caratteristiche
• Estremamente labili, facilmente
distrutte dal calore, dall’ossidazione, dai
processi di estrazione e dalla digestione
pepsinica
• reazioni OAS
• I pazienti allergici a proteine Bet v 1
omologhe riportano frequentemente una
buona tolleranza per gli alimenti cotti e
per i succhi di frutta commerciali
mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,
pomodoro, ontano, nocciolo, carpino
Lipid Transfer Protein
Allergeni
Pesca (Pru p 3), mela (Mal d 3),
albicocca (Pru ar 3), ciliegia (Pru
av 3), prugna (Pru d 3), nocciola
(Cor a 8), castagna (Cas s 8), mais
(Zea m 14), asparago (Aspa o 1),
orzo ( Hor v ), uva (Vit v 1), lattuga
(Lac s 1), arachide (Ara h 9 ),
senape
Caratteristiche
• Presenti nella buccia delle Rosacee
• Resistenza alla pepsina e al calore
• Reazioni sistemiche
• Pazienti allergici alle LTP riportano
frequentemente una buona tolleranza
alla frutta sbucciata
• Essenzialmente presenti nel sud
Europa (Italia e Spagna)
Famiglia delle Rosaceae
Pru p 1
Pru ar 1
Pru d 1
Pru p 3
Pru ar 3
Pru d 3
Pru p 4
Pru ar 4
Pru d 4
Mal d 1
Pyr c 1
Pru av 1
Mal d 3
Pyr c 3
Pru av 3
Mal d 4
Pyr c 4
Pru av 4
Somiglianza di queste componenti tra differenti frutti con nocciolo
Pru p3
LTP - Frutta e noci
• Rosaceae
–
–
–
–
–
–
Pera
Pesca
Ciliegia
Albicocca
Mandorla
Zucca
•
•
•
•
•
•
Noce
Nocciola
Mais
Semi di sesamo
Semi di girasole
Birra (LTP dell’orzo, stabilizzante per
fermentazione)
• Uva
• Arachidi
• Senape
Esiste solo una LTP?
Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro
TUTTE le LTP!!!!
Pru p 3
Par j 2
Cor a 8
Omologia tra LTP
Plant nsLTP as food and pollen allergens Saledo G.et al Clin Exp Allergy 2004,34
Allergia a proteine di deposito
2S Albumine
Arachide (Ara h 2, 6, 7), senape, noce
brasiliana (Ber e 1), noce (Jug r 1), semi di
ricino (Ric c 1, 3), semi di sesamo (Ses i 1,
2), anacardio (Ana o 3), semi di girasole
Viciline
Arachide (Ara h 1),lenticchia (len c 1),
nocciola (Cor a 11), noce (Jug r 2), semi di
sesamo (Ses i 3), anacardio (Ana o 1)
Legumine
Arachide (Ara h 3), noce (Jug r 4),
anacardio (Ana o 2), nocciola (Cor a 9)
Caratteristiche
• Allergeni estremamente stabili
• Sensibilizzazione sia per via
gastrointestinale che respiratoria
• Resistenza alla pepsina e al calore
• Spesso associate a reazioni sistemiche