I materiali biologici per l’esame colturale:
tipologia ed importanza di un corretto
prelievo
Diagnostica Microbiologica delle Infezioni delle Basse Vie Respiratorie
Firenze, 13 Marzo 2007
A. Raglio, A Grigis
A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo
U.O. Microbiologia e Virologia
Direttore Dott A. Goglio
1
I temi
 Il problema
 Il nemico
 L’importanza di un corretto prelievo
 I materiali biologici
 Criteri di idoneità
2
IL PROBLEMA
La polmonite acuta
è fra le prime sei cause di morte ed
è la più comune causa di mortalità correlata a infezione
(Mandell 99)
Tanti quadri clinici
Tanti patogeni
Tanti materiali biologici
Poche diagnosi
Solo nel 20-50% delle polmoniti comunitarie
si riesce a raggiungere una diagnosi eziologica
Mancanza di:
- standardizzazione
3
- test di riferimento (gold standard)
CAP: Principali patogeni isolati in corso
di differenti studi di sorveglianza
60
S. pneumoniae
H. influenzae
50
Legionella
40
Gram negativi
nessun patogeno
% 30
20
10
0
28/01
Rello 1996
Moine 1994
Feldman 1995
4
IL NEMICO
28
28
10
2
5
5
Batteri
Virus
Funghi
Rickettsie
Mycoplasmi e Chlamydie
Parassiti
Mandell, Infectious Diseases, Fourth Edition
5
I microbi del cavo orale
- Flora endogena
del cavo orale:
10 15
1. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0. 0 0 0
6
Flora naso-orofaringea
Opportunisti
(raramente patogeni)
- Str. - emolitici
- S.coag.negativi
- neisseriacee
- Candide
- Haemophilus spp
- Actinobacillus spp
- Anaerobi
-………...
Normalmente non
presenti:
- BGN (ferm. e non)
- Enterococchi
-…….
Ma nei pz intubati sì
7
Flora naso-orofaringea
Patogeni (stato di portatore sano)
- S. aureus
- N. meningitidis
- S. pneumoniae
- Haemophilus influenzae
-………...
35-40 %
5-15 %
0-50 %
5-20 %
8
Infezioni comunitarie
Infanti-bambini:
-> 80% virali: Influenza, RSV, adenovirus,…..
- altre: Haemophilus, S. pneumoniae, S.aureus
Adulti giovani:
-> batteriche: M. pneumoniae
Adulti e anziani:
- < 10-20% virali
- altre: S. pneumoniae, Haemophilus, S.aureus
e BGN fermentanti e non
9
Polmonite ospedaliera o nosocomiale
- La seconda I.O. per frequenza
(27% di tutte le I.O.in TI)
- Prevalentemente batterica
- S. aureus (MSSA)
- S. pneumoniae, H. influenzae
------------------------ Enterobatteri
- Bacilli GN non fermentanti
- S. aureus (MRSA)
- Elevata mortalità
10
VAP: agenti eziologici in base al tempo
CDC Draft 2002
Early Onset Pneumonia EOP
Late Onset Pneumonia LOP
E.coli
Klebsiella spp
Proteus spp
S.pneumoniae
H.influenzae
MSSA
P.aeruginosa
BGN con ESBL
MRSA
Acinetobacter spp
……….
NON Multi R
Spesso Multi R
11
Immunodepressi per
patologia di base
- Fibrosi cistica:
- P. aeruginosa (spesso mucoso)
- Alcaligenes spp
- B. cepacia
- S. maltophilia
- S. aureus
- H. influenzae (anche non b) e
S.pneumoniae
- Aspergillus
- Micobatteri spp
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Il nemico
Occorre conoscerne:
la patogenicità e i meccanismi di virulenza
le caratteristiche colturali (esigenze
nutritive, l’atmosfera di crescita, i tempi di
crescita) e la carica per distinguerlo fra la
flora contaminante
i determinanti antigenici
le sequenze identificative
le sensibilità ad antibiotici e disinfettanti
13
L’importanza di un prelievo corretto
oppure meglio:
L’importanza di una
interpretazione corretta in
base al prelievo
14
Contributo della
microbiologia
Diversamente da altre indagini strumentali e di
laboratorio, la richiesta di indagini microbiologiche presenta
aspetti peculiari:
il tipo e la qualità del campione condizionano in modo assoluto
i risultati dell'indagine microbiologica,
l'invio del campione al microbiologo sottintende la domanda:
"C'è qualcosa nel campione che può contribuire alla diagnosi ed
alla terapia della malattia infettiva?"; ciò equivarrebbe ad
inviare al Laboratorio di chimica clinica un campione di sangue
"per ricerca di anormalità chimiche", senza ulteriore
indicazione o precisazione
15
Contributo della
microbiologia
Garbage in
Garbage out
16
Il Manuale di raccolta
M&V
Ospedali Riuniti di Bergamo
PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED INVIO
DEI CAMPIONI
PER INDAGINI MICROBIOLOGICHE
3a ed., maggio 2001, pag. 114
www.ospedaliriuniti.bergamo.it
Altri Manuali consultabili al sito: www.apsi.it
17
Iter dell’indagine microbiologica
18
Polmoniti
Campioni per la diagnosi eziologica
 Materiali raccolti con metodiche protette, a bassa
contaminazione
 Lavaggio bronco-alveolare (BAL)
 Lavaggio bronco-alveolare mirato con cateterino
 Spazzolatura endobronchiale protetta (PSB)
 Materiali ad alto rischio di contaminazione con saliva
 Espettorato (o espettorato indotto o indotto-protetto)
 Aspirato endotracheale / bronchiale / da tracheostomia
 Altri materiali






Materiali bioptici
Liquido pleurico
Sangue (emocoltura, indagini sierologiche)
Succo gastrico (per micobatteri)
Tampone (aspirato) naso-faringeo (virus)
Urine (ricerca antigeni Legionella , Pneumococco)
19
Aspirato tracheo-bronchiale
 Di semplice esecuzione, non richiede manovre invasive
 La coltura identifica di solito il patogeno in causa (alta
sensibilità), ma insieme ad altri microrganismi non
responsabili dell’infezione (bassa specificità)
 L’indagine microbiologica deve:
determinare la carica batterica (coltura quantitativa)
accompagnarsi all’esame microscopico (batteri e cellularità)
Grossman R, Chest, 2000
20
Aspirato tracheo-bronchiale
Fonte
N.
Hill (1976)
Berger (1985)
48
19
Villers (1985)
17
Torres (1985)
Lambert (1989)
41
22
Sensibilità Specificità
Riferimento
%
%
Biopsia, Emocoltura,
82
27
liq.pleurico
74
Autopsia
Biopsia, Emocoltura,
88
0
liq.pleurico, sierol.
57
14
PBS, BAL
88
33
PBS
San Pedro, Chest, 2001
21
Lavaggio broncoalveolare
 Procedura invasiva
 Fattori che condizionano la “qualità” del BAL
competenza dell’esecutore
recupero > 10% della soluzione instillata
immediato invio alla microbiologia
terapia antibiotica in corso
 Idoneità del campione
> 10 cellule per campo a x500
presenza di < 1% di cellule epiteliali
Grossman R, Chest, 2000
22
Prelievi “protetti” e risultati
microbiologici
Sensibilità
Specificità
Valore
predittivo
Positivo
Valore
predittivo
Negativo
Colture PSB (>103 CFU/mL)
82%
89%
90%
89%
Colture BAL (>104 CFU/mL)
91%
78%
83%
87%
Esaminazione microscopica di fluidi
da BAL (>5% organismi
intracellulari)
91%
89%
91%
89%
Tecniche diagnostiche
Mayhall G., Emerging Infectious Diseases, 2001
Tecniche diagnostiche
Sensibilità
Specificità
Colture PSB(>103 CFU/mL)
67%
95%
Colture BAL(>104 CFU/mL)
73%
82%
37-100%
89-100%
Esaminazione microscopica di fluidi
Grossman
da BAL R., Chest, 2000
23
Grosman R, Chest, 2000
Infezioni delle basse vie respiratorie
Solo se CAP grave:
Espettorato o BroncoAsp
Emocoltura
(IDSA 2007)
Possibilmente
campioni protetti
Solo campioni protetti:
Broncolavaggio
Spazzolatura
Emocoltura
(FADOI,’07)
24
Diagnosi delle infezioni respiratorie
- Più del 50% non sono diagnosticate
- Non c’è un solo test per fare diagnosi
- coltura secrezioni
- emocoltura
- ricerca antigeni (RSV, Legionella,
S.pneumoniae, Aspergillus,…)
- Per i batteri, spesso non è un
problema tecnico, ma di
interpretazione !!!!
25
Diagnosi: due quesiti
- Se isolo patogeni (spesso presenti anche nel
cavo orale), sono quelli colonizzanti o sono quelli
che hanno raggiunto il polmone?
In pratica:
Ho raccolto quelli del cavo orale o quelli
dell’infezione ?
26
Diagnosi: due quesiti
- Se isolo non patogeni (normalmente non
presenti nel cavo orale), sono quelli che hanno
colonizzato il tratto respiratorio alto o hanno
raggiunto anche il polmone?
In pratica:
Ho raccolto quelli delle alte vie o quelli
dell’infezione ?
27
Infezioni delle basse vie respiratorie
La contaminazione
con la flora del cavo
orale inficia il
risultato dell’esame
colturale
28
Campioni NON protetti
Passano attraverso il cavo orale:
- Espettorato (anche indotto,
protetto)
Raccolti con broncoscopio attraverso il cavo orale:
- Lavaggio tracheo-bronchiale
Raccolti con aspirazione:
- durante la broncoaspirazione di intubati:
- Aspirato tracheo-bronchiale
- attraverso fistola tracheostomica:
- Aspirato da tracheo-stomia
29
Diagnosi
Come evitare la raccolta dei
colonizzanti?
30
Campioni protetti
- PSB= Brushing endo-bronchiale protetto
- Mini-BAL= Lavaggio bronco-alveolare
protetto
- BAL= Lavaggio bronco-alveolare
compromessi o polmoniti interstiziali)
(più negli immuno-
31
32
33
34
35
36
VAP: Diagnosi
CDC Draft 2002 -GISIG 1998
- i criteri tradizionali:
- clinici (tosse, febbre, leucocitosi, secrezioni
purulente)
- strumentali (evidenze radiologiche di un
infiltrato nuovo o progressivo)
- microbiologici (coltura dell’aspirato
endotracheale, l.pleurico, sangue)
NON SONO SUFFICIENTI PER UNA VAP
PERCHE’ ASPECIFICI E INAFFIDABILI
37
VAP: Standardizzazione dei metodi
diagnostici
CDC Draft 2002 -GISIG 1998
- PSB (Protected Specimen Brush)
- BAL (Broncho-Alveolar Lavage)
- Mini-BAL (Protected Broncho-Alveolar Lavage)
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Criteri di idoneità
Esame microscopico
Cellule bronchiali epiteliali squamose
Neutrofili
Batteri intracellulari
Flora Cavo Orale
Semina
Non Protetti con 1 mcl
Protetti con 10 mcl
Rilevazione cariche
Non Protetti > 106 ucf/ml
Broncolavaggio > 104 ucf/ml
Mini-BAL
> 102 ucf/ml
Identificazione microrganismi
Patogeni
Non Patogeni
39
Esame microscopico
Idoneo
Non idoneo
40
41
42
43
Esame microscopico: Q-score
Tabella 1
Cellule epiteliali squamose (CS)
Lettura del Gram
Referto
Globuli
bianchi
(GB)
0
1-9
10-24
>25
0
+
++
+++
0
0
1-9
+
0
-1
+1
0
+2
+1
+3
+2
Punteggio " Q "
10-24
++
>25
+++
-2
-1
0
+1
-3
-2
-1
0
Lettura: media di 10 campi
44
Semina NON protetti
Significative cariche >106 (10-100 UCF)
45
Semina protetti
Significative cariche >103 (1-10 UCF)
(104 per BAL: 10-100 colonie)
46
…e valutare il germe in causa
Cioccolato 1l (diluito
1:10)
- assenza crescita
-1
CFU = 104
- 10
CFU = 105
- 100 CFU = 106
> 100 CFU = 107
Patogeni
Non Patogeni
FBM
ATB +ID
descrittivo
FBM
47
Microrganismi respiratori
Patogeni
Non patogeni
-BGN (fermentanti e non)
-S. pneumoniae e beta-emolitici
-S.aureus
-Haemophilus influenzae
-B.catarrhalis
-
S.coagulasi negativi
Strept. alfa-emolitici
Neisseriaceae
Altri Haemophilus
48
Emocoltura
20-30% polmoniti batteriche hanno batteriemia
L’emocoltura dovrebbe essere sempre eseguita
in caso di polmonite
49
Collaborare per vedere i problemi per quel che sono
50
Tenersi informati
51