Review n. 12 - Italus Hortus 17 (4), 2010: 43-55
Utilizzo dell’1-metilciclopropene (1-MCP) per lo studio della fisiologia
postraccolta e della maturazione dei frutti
Roberta Tosetti1, Wendy C. Schotsmans2, Robert K. Prange3, Pietro Tonutti 1 e Claudio Bonghi4*
1 Scuola Superiore Sant’Anna , piazza Martiri della Libertà 33, 56100 Pisa
2 IRTA, Postharvest Department, Av. Alcalde Rovira Roure, 191, 25198 Lleida (Spagna)
3 Agriculture and Agri-Food Canada, Atlantic Food and Horticulture Research Centre, Main Street 32,
Kentville, Nova Scotia B4N 1J5 (Canada)
4 Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali, Università di Padova, viale
dell’Università 16, 35020 Legnaro (PD)
Ricezione: 3 maggio 2010; Accettazione: 5 luglio 2010
Postharvest use of 1-Methylcyclopropene (1-MCP) and fruit ripening
physiology
Abstract. The discovery of 1-methylcyclopropene
(1-MCP) as an inhibitor of ethylene action has provided an important tool in understanding fruit ripening
physiology as shown by the huge amount of 1-MCPtargeted research carried out particularly, although not
exclusively, in postharvest science. It has been clearly
demonstrated that 1-MCP is able to improve the handling procedures and storage life of a number of commodities. In fact, 1-MCP can reduce ethylene biosynthesis, respiration, softening color changes, aroma
production, and the occurrence of physiological disorders and stress responses. These effects are related
to the interference of 1-MCP on the ethylene receptor
functioning (1-MCP-receptor binding is irreversible)
and for some of them in their transcription rate and
protein stability. However, the efficacy of this olefin
strongly depends upon the concentration used, the
species and variety, storage condition and duration,
and maturity of the fruit before the 1-MCP application.
A marked effect of 1-MCP occurs in climacteric fruit,
although studies carried out in nonclimacteric fruit
demonstrates that this olefin can also alter specific
ripening processes in these fruit types. The research
results obtained by applying 1-MCP confirms the very
well-known ethylene-dependent ripening processes as
well as allowed the identification of previously unrecognized responses to ethylene. Molecular studies performed on 1-MCP-treated fruit have provided new
insights into the role of ethylene in the regulation
(mainly at the transcriptional and, to a lesser extent, at
the translational level) of genes involved in ripening
processes such as cell wall metabolism, and pigment
and aromatic compound biosynthesis, as well as the
signal transduction pathway of the gaseous hormone.
Postharvest use of 1-MCP has improved our under*
standing of ethylene effects on the development of
physiological disorders (e.g. superficial scald, internal
breakdown) and stress responses (e.g. chilling injury
and pathogen attack). This extensive information base
will be extremely useful in the future development of
innovative and more efficient postharvest strategies
where the effect of 1-MCP could be enhanced by the
concomitant applications of other storage technologies.
Key words: antioxidants, aromas, ethylene, firmness, physiological disorders, pigmentation, receptors.
Introduzione
L’interesse suscitato dall’1-metilciclopropene (1MCP) come regolatore della maturazione dei frutti
(principalmente climaterici, ma non solo) è testimoniato dal rilevante numero di pubblicazioni (più di
560 articoli a partire dal 2000 ad oggi) riguardanti
sperimentazioni condotte con questo inibitore dell’azione dell’etilene. Queste ricerche hanno dimostrato
che l’1-MCP può rallentare il decorso della maturazione riducendo la biosintesi di etilene e conseguentemente la perdita di consistenza della polpa, l’accumulo di pigmenti (come antociani e carotenoidi) e la produzione di aromi (come lattoni e terpeni) nonchè l’incidenza di disordini fisiologici. Tuttavia, l’efficacia
del trattamento con 1-MCP nel rallentare il processo
di maturazione è fortemente condizionata dalla specie
e dalla cultivar, dalla durata della fase di conservazione e, soprattutto, dallo stadio di sviluppo del frutto al
momento dell’applicazione, l’ambiente di coltivazione e la presenza di trattamenti e/o tecnologie postraccolta aggiuntive all’1-MCP. L’elevata variabilità dei
risultati ottenuti in seguito all’applicazione dell’1MCP ha indotto a riconsiderare il ruolo dell’etilene
[email protected]
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Tosetti et al.
nel processo di maturazione dei frutti. La presente
review, focalizzando l’attenzione sull’uso dell’1-MCP
come modulatore del livello dei recettori dell’etilene,
riporta le più recenti informazioni dei suoi effetti sui
processi della maturazione dei frutti e su alcuni meccanismi di regolazione etilene-dipendenti.
La scoperta dell’1-MCP
La scoperta che i ciclopropeni, tra cui l’1-MCP,
potevano funzionare come inibitori dell’azione dell’etilene fu dovuta alla ricerca di molecole in grado
legarsi in maniera stabile ai suoi recettori al fine di
rendere più facile l’identificazione di quest’ultimi. La
scelta cadde sull’1-MCP essendo più attivo del 3metilciclopropene e del 3,3-dimetilciclopropene e più
stabile del ciclopropene (Sisler e Serek, 1999; Sisler
et al., 2001). L’1-MCP è stato inizialmente commercializzato come polvere stabile (in cui è complessato
con γ-ciclodestrina) (Watkins, 2006) e, più recentemente, in una formulazione liquida che ne ha agevolato l’applicazione (Elfving et al., 2007).
Il Meccanismo di azione dell’1-MCP
Il sistema recettoriale dell’etilene
Come ricordato precedentemente l’1-MCP è in
grado di inibire l’azione dell’etilene legandosi ai suoi
recettori e in questa review verranno riportate le più
recenti informazioni sul meccanismo di percezione
dell’ormone rimandando per una trattazione più completa sulla sua catena trasduttiva a quanto descritto da
Cho e Yoo (2009).
In Arabidopsis, l’etilene, prodotto in seguito a
segnali endogeni ed esogeni (stress o patogeni), è percepito a livello cellulare attraverso una serie di recettori [fig. 1, ETHYLENE RESPONSE1 (ETR1), ETR2,
ETHYLENE RESPONSE SENSOR1 (ERS1), ERS2, e
ETHYLENE INSENSITIVE4 (EIN4) (Bleecker et al.,
1988; Chang et al., 1993; Hua et al., 1998; Sakai et
al., 1998)], localizzati sul reticolo endoplasmatico. Il
più accreditato meccanismo di azione dell’etilene
imputa ai recettori un ruolo di regolatori negativi
(Binder e Bleecker, 2003). Infatti, in assenza dell’ormone questi recettori attivano la proteina citoplasmatica CTR1 (CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1),
una putativa proteina chinasica (Raf-like mitogenactivated protein kinase kinase kinase, MAPKKK,
identificata da Kieber et al., 1993), che esercita una
azione repressiva sui componenti della catena trasduttiva (Kieber et al., 1993; Huang et al., 2003). In presenza di etilene la stabilità del complesso recettoreCTR1 è ridotta e con essa la sua azione repressiva
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sulla trasduzione dell’ormone (Wang et al., 2006). La
rimozione del blocco determina l’accumulo di EIN2
(ETHYLENE INSENSITIVE 2), un trasportatore di
membrana, attraverso cui avviene la canalizzazione
del segnale ormonale verso il nucleo (Alonso et al.,
1999; Guo e Ecker, 2003) dove vengono attivati fattori di trascrizione (tipo EIN3, ETHYLENE INSENSITIVE 3 o EIL EIN3-like, ETHYLENE INSENSITIVE 2)
(Chao et al., 1997) in grado di indurre a loro volta la
trascrizione di ETHYLENE RESPONSIVE FACTORS
(tipo ERF1; Alonso et al., 2003). Gli ERF possono,
legandosi a regioni ricche nella sequenza GGC, stimolare la trascrizione di geni coinvolti nei processi
etilene-dipendenti. La possibilità di regolare la sensitività all’etilene dipende, oltre che dal livello di recettori (vedi paragrafo successivo), dalla stabilità proteica
di EIN2 e di EIN3 ottenuta, rispettivamente, attraverso
l’attivazione di complessi EIN2 TARGETING F-box
PROTEIN1 (ETP1) e ETP2 (Qiao et al., 2009) e di
EIN3 BINDING F-BOX PROTEIN1 (EBF1) e EBF2
(Gagne et al., 2004) con il proteosoma 26S.
Controllo del livello dei recettori
Il modello che assegna ai recettori un controllo
negativo sull’azione dell’etilene suggerisce che la sensibilità all’ormone aumenti quando la quantità di
recettori liberi diminuisce. Questa assunzione riconosce nella dinamicità - intesa come frequenza degli
eventi di sintesi e degradazione- del complesso recettoriale il principale elemento del controllo della sensitività all’ormone. Sulla base di tale lettura sono stati
condotti numerosi studi aventi come oggetto analisi di
espressione in frutti in via di sviluppo e maturazione.
L’analisi comparata dei dati pubblicati mette in evidenza che il livello di espressione dei geni codificanti
per le proteine recettoriali varia in maniera significativa da specie a specie e, all’interno di queste, da cultivar a cultivar e con esso l’efficacia del trattamento con
1-MCP (Watkins, 2006). Infatti, Dal Cin et al. (2006)
hanno osservato che durante la maturazione della mela
e della pesca si verifica, parallelamente all’incremento
di etilene, l’aumento dei trascritti dei recettori di tipo
ETR1 ed ERS1, ma che in seguito al trattamento con
1-MCP si assiste a una diminuzione consistente del
livello di questi trascritti solo in mela. L’applicazione
dell’1-MCP produce effetti simili a quelli ottenuti
nella mela in altri frutti climaterici come l’avocado
(Owino et al., 2002), ma anche nei frutti non climaterici come quello della vite (Chervin et al., 2005).
Particolarmente interessanti appaiono anche le differenze in termini di livello di trascritti e di effetto
dell’1-MCP in due cultivar di susino caratterizzate
dalla presenza (cv Early Gold, EG) o assenza (cv
1-MCP per la fisiologia postraccolta e la maturazione dei frutti
Fig. 1 - Modello di recezione e trasduzione del segnale dell’etilene in Arabidopsis. L’etilene è sintetizzato a partire dalla metionina
attraverso, nelle fasi finali, l’azione sequenziale dell’1-amminociclopropanocarbossilato sintetasi (ACS) ed ossidasi (ACO). Il suo
complesso recettoriale è formato da cinque membri che, in assenza di etilene, interagiscono in modo differenziale con la proteina
citoplasmatica CTR1. CTR1 è una putativa chinasi (MAPKKK) che può attivare a cascata delle altre chinasi (MKK e MPK) in grado di
fosforilare, a livello nucleare, EIN3 e EIL. La fosforilazione incrementa l’affinità di EIN3 ed EIL1 a EBF1 ed EBF2, due F-box protein
che promuovono la degradazione delle proteine attraverso il proteosoma 26S e, conseguentemente, la soppressione della risposta
all’etilene. In presenza di etilene, i recettori si dissociano da CTR1 e viene attivato il complesso MKK9-MPK 3/6 che fosforila i fattori
EIN3 ed EIL1. In questo caso la fosforilazione rende meno affini EIN3 ed EIL1 a EBF1 ed EBF2 impedendo, in tal modo, la loro
degrdazione via proteosoma. Non è ancora chiaro se il complesso MKK9-MKP3/6 è attivato da una MAPKKK diversa da CTR1. EIN2 è
una proteina di membrana che canalizza il segnale dell’etilene al nucleo. La sua stabilità è sotto il controllo di due F-box protein: ETP1 ed
ETP2. La funzionalità di EIN2 è cruciale per l’accumulo di EIN3. (Ridisegnato da Cho e Yoo, 2009).
Fig. 1 - Model for ethylene perception and transduction in Arabidopsis. Ethylene is synthesized starting from methionine through, in the
last steps, the sequential action of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACS) and oxidase (ACO). Ethylene receptor complexes
comprise five partially redundant members that, in absence of ethylene, are able to differentially interact with the cytoplasmatic protein
CTR1. CTR1 is a putative kinase (MAPKKK) that might activate multiple MKKs and MPKs as cascade and phosphorylate EIN3 and EIL1
in the nucleus. This might enhance their affinity toward EBF-1 and -2, two F-box proteins that promote protein degradation through 26S
proteasome and, thus, the suppression of ethylene signaling. Upon ethylene binding to receptors, the receptor–CTR1 complexes are
inactivated, resulting in activation of MKK9–MPK3/6 cascade, which phosphorylates EIN3 and EIL1 in the nucleus. MKK9–MPK3/6dependent phosphorylation of EIN3 and EIL1 probably increases their stability by reducing their affinity toward EBF-1 and -2. It is
unclear whether MKK9–MPK3/6 is activated by a MAPKKK that differs from CTR1. EIN2 is a membrane protein that accumulates upon
ethylene signaling. Its stability is under control of two F-box proteins: ETP1 and -2. Intact EIN2 functioning is crucial for accumulation of
EIN3. (Modified from Cho e Yoo, 2009).
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Tosetti et al.
Shiro, SH) del picco di etilene durante la maturazione
(El-Sharkawy et al., 2007). Nelle due cultivar, infatti,
il livello dei recettori di tipo ETR1 aumenta in maniera significativa (sebbene più abbondante in EG) mentre per i recettori di tipo ERS1 si assiste ad un aumento solamente nella cv EG. Il trattamento con 1-MCP
determina una diminuzione dei trascritti di entrambi i
recettori solo nella cv EG, mentre nella cv SH non si
osserva alcun significativo effetto depressivo sulla
loro trascrizione. Questi dati suggeriscono che il livello di etilene raggiunto durante la maturazione sia un
fattore essenziale per l’evoluzione del complesso
recettoriale e per la risposta al trattamento con 1MCP. L’importanza di tale relazione è stata ribadita
da Zhang et al. (2009) che hanno osservato, sottoponendo frutti di pomodoro a trattamenti combinati o in
sequenza di etilene ed 1-MCP, che elevati livelli di
etilene e perdita della sensibilità all’1-MCP sono positivamente correlati. Questo risultato è congruente con
l’osservazione che frutti di avocado (Adkins et al.,
2005) e melo (Toivonen e Changwen, 2005), se trattati con 1-MCP nella fase finale della maturazione,
quando si registrano livelli di etilene elevati, sono
insensibili all’1-MCP. Reid e Çelikel (2008) hanno
ipotizzato un modello del meccanismo di azione
dell’1-MCP, basato sulle risposte del garofano a questa molecola, che può fornire una possibile spiegazione dell’insieme dei dati sopra riportati (fig. 2). In questo modello, a livello dei recettori, si postula l’esistenza di due distinti siti di aggancio per l’etilene e per
l’1-MCP e che quello per l’inibitore diventi accessibile, in seguito a modifiche allosteriche, quando i recettori, in assenza di etilene, sono agganciati a CTR1
(fig. 2A). L’ 1-MCP si aggancia, in modo irreversibile, al suo specifico sito sul complesso recettore-CTR1
impedendo, attraverso un’altra modifica allosterica,
l’esposizione del sito di legame dell’etilene (fig. 2B).
Se il trattamento con 1-MCP è effettuato in presenza
di elevati livelli di etilene, la maggior parte dei recettori è dissociata da CTR1 e il sito di aggancio per l’inibitore non è più accessibile (fig. 2C).
Un ulteriore meccanismo di controllo del livello
dei recettori risiede nel controllo della stabilità delle
proteine recettoriali. Kevany et al. (2007) hanno
dimostrato che, in frutti di pomodoro, la degradazione
delle proteine recettoriali viene attuata attraverso l’attivazione di proteosomi (fig.1). Gli stessi autori hanno
dimostrato che l’aggancio dell’etilene è necessario
per avviare il processo di degradazione in quanto trattamenti con l’1-MCP, che si lega ai recettori al posto
dell’etilene, sono in grado di ridurre l’entità della
degradazione. Questa informazione consente di supporre che, in presenza di elevati livelli di etilene, il
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meccanismo di controllo negativo della sensibilità
all’ormone, che è correlato alla presenza di recettori
di neosintesi, non sia più funzionante.
Il recupero della sensitività all’etilene dopo il trattamento con 1-MCP
Il prolungamento dell’effetto inibitorio dell’1MCP, a seguito di applicazioni ripetute in successione
alla prima, osservato in specie quali melo
(Hoeberichts et al., 2002) e pesco (Mathooko et al.,
2001) ha confermato l’ipotesi che il recupero della
sensitività all’etilene sia dovuto alla comparsa di
nuovi recettori (Blankenship e Dole, 2003). La prima
conferma della rigenerazione del livello recettoriale è
venuta dagli esperimenti condotti da Tassoni et al.
(2006) su pomodoro. Questi autori, infatti, hanno
osservato che il trattamento con 1-MCP inizialmente
induce una riduzione della trascrizione dei recettori
associati alla maturazione (LeETR4, 5 e 6), ma dopo 8
giorni il livello di questi trascritti è paragonabile a
quello dei frutti di controllo. Il fattore che innesca
l’avvio della rigenerazione va ricercato nelle diversità
fisiologiche delle varie specie. Per quanto riguarda le
pesche, che recuperano assai velocemente la sensibilità all’etilene al termine del trattamento con 1-MCP,
è stato osservato (Ziliotto et al., 2008) che il ritorno
ad un normale decorso della maturazione è parallelo
alla rapida riattivazione della percezione e della trasduzione dell’etilene, come attesta l’aumento della
trascrizione di un recettore ETR2-simile e di fattori di
trascrizione di tipo ERF a 48 ore dalla fine del trattamento. La rapida ripresa della trascrizione di ETR2 e
degli ERF, identificati come geni etilene-dipendenti
(Trainotti et al., 2007), è spiegata dagli autori con il
blando effetto inibitorio dell’1-MCP sull’accumulo
dei trascritti dei geni chiave della biosintesi dell’etilene (ACC ossidasi e, in particolare ACC sintetasi, vedi
Fig. 1), già evidenziato da Mathooko et al., 2001, e da
Dal Cin et al., 2006, che comporta il mantenimento di
discreti livelli dell’ormone anche durante il trattamento con l’1-MCP. Le differenze osservate fra diverse
tipologie di frutti nella risposta all’1-MCP sarebbero
quindi da imputare anche a peculiari meccansimi
strutturali e funzionali (famiglie geniche, regolazione
della trascrizione dei singoli membri) della via biosintetica dell’etilene.
Effetti dell’1-MCP sui più importanti processi
della maturazione dei frutti
Una delle più importanti conseguenze dell’impiego
dell’1-MCP sui frutti in via di maturazione è l’inibizione della sintesi di etilene (vedi voci bibliografiche
1-MCP per la fisiologia postraccolta e la maturazione dei frutti
Fig. 2 - Modello del meccanismo di azione dell’1-MCP proposto da Reid e Çelikel (2008). A) In assenza di etilene, i recettori (ETR1)
interagiscono con CTR1 permettendo anche l’esposizione del sito di aggancio dell’1-MCP; B) quando l’1-MCP (coni) è agganciato, le
modificazioni allosteriche non rendono disponibile il sito di legame per l’etilene e, conseguentemente, consentono il mantenimento
dell’azione negativa del complesso recettore-CTR1 sulla trasduzione del segnale dell’etilene; C) In presenza di elevati livelli di etilene
(sfere), CTR1 è rilasciato e il sito di aggancio per l’1-MCP non risulta più disponibile.
Fig. 2 - Schematic model for the action mechanism of 1-MCP proposed by Reid e Çelikel (2008). A) When ethylene is absent, receptors
(ETR-1) interact with CTR1 and reveal a domain to which 1-MCP can bind. (B) When 1-MCP (cones) binds, for allosteric changes the
ethylene-binding pocket is not exposed thus the negative action of complex receptor-CTR1 on ethylene transduction kinase is irreversibly
turned ON. (C) In presence of high level of ethylene (spheres), the complex receptor-CTR1 is turned OFF and the 1-MCP-binding pocket
is therefore not exposed.
riportate in Watkins, 2006) e, con essa, di quei processi regolati dall’ormone che caratterizzano la sindrome
della maturazione sia nei frutti climaterici che non climaterici. Questi processi riguardano, in particolare la
perdita di consistenza, il viraggio del colore, lo sviluppo di sostanze aromatiche e il metabolismo di composti con proprietà antiossidanti.
Metabolismo della parete cellulare
Il metabolismo parietale dei frutti in maturazione
(e la conseguente perdita di consistenza) è uno degli
aspetti che, con maggiore intensità, si è cercato di con-
trollare con l’applicazione di 1-MCP. Il rammollimento e la perdita di consistenza che si verificano durante
la maturazione in un frutto sono il risultato di una
complessa serie di processi di biosintesi e degradazione che avvengono secondo una precisa scansione temporale a livello dei vari componenti e dei domini della
parete cellulare; nonostante siano simili, questi processi possiedono meccanismi di regolazione e di interazione variabili che, anche a causa della diversa composizione delle pareti cellulari, determinano andamenti diversi di perdita di consistenza nelle varie tipologie
di frutto (Huber et al., 2003). Va sottolineato che per
47
Tosetti et al.
quanto riguarda la consistenza, importante è anche il
ruolo svolto dal turgore cellulare. Alcuni dati indicherebbero che l’1-MCP possa esercitare un’influenza
positiva nella riduzione della perdita di acqua durante
la conservazione di mele e pere (Baritelle et al.,
2001), ma questo aspetto deve ancora essere indagato
in modo approfondito.
I principali attori che entrano in gioco durante il
metabolismo parietale sono gli enzimi di parete e le
proteine strutturali, in particolar modo le poligalatturonasi (PG) e le pectin metilesterasi (PME) che agiscono sulla matrice pectica della parete, ma un ruolo
importante è anche svolto da endoglucanasi (EG),
pectato liasi (PL), pectin esterasi (PE), glicosidasi ed
espansine (EXP). In letteratura si trovano diversi
lavori che mettono in relazione gli effetti dell’1-MCP
con l’espressione dei geni e/o l’azione degli enzimi
sopracitati, e in generale si può affermare che il trattamento con l’inibitore dell’azione dell’etilene rallenta
il processo di rammollimento nel frutto, anche se ciò
avviene in maniera e con una intensità ed efficacia
differenti a seconda del frutto e degli aspetti tecnici
del trattamento (Lurie et al., 2002; Hiwasa et al.,
2003; Itai et al., 2003; Lohani et al., 2004; Mwaniki
et al., 2005). Nel caso delle mele, frutto su cui l’1MCP viene ampiamente utilizzato, la cv Golden
Delicious risponde meglio della cv Fuji in termini di
mantenimento della consistenza e ciò sarebbe da
imputare ad una diversa regolazione dell’espressione
di specifici geni del metabolismo parietale. Nella cv
Golden Delicious la riduzione dell’espressione di PG,
PME, β-galattosidasi e α-L-arabinofuranosidasi
indotta da 1-MCP è infatti più marcata che in quella
Fuji (Wei et al., 2010). Questi autori ipotizzano che,
rispetto alle PG e alle PME, le glicosidasi siano più
strettamente collegate con la conservabilità delle mele
e che le PME agiscano nei primi stadi di rammollimento, mentre le PG siano coinvolte in quelli successivi. Differenti risposte tra cultivar sono state anche
osservate in albicocca: comparando le cv Ceccona e
San Castrese si è notato che in quest’ultima il trattamento con 1-MCP inibisce l’azione solo delle PME e
della glicosidasi α-mannosidasi mentre nella cv
Ceccona risultano inibite le attività di tutte le glicosidasi esaminate (α-galattosidasi, α-glucanasi, α-mannosidasi, β-galattosidasi, β-glucanasi e β-xylanasi),
ma non delle PME (Botondi et al., 2003). Ciò è stato
messo in relazione al diverso effetto tecnologico
dell’1-MCP che è risultato essere più efficace nel
ritardare il processo di maturazione nella cv Ceccona.
Uno studio svolto su nettarine, tramite un’analisi trascrizionale con il microarray PEACH1.0, ha confermato che alla fine del periodo di incubazione (24 h),
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il mantenimento della consistenza nei frutti trattati è
accompagnato da una significativa alterazione dei
profili trascrizionali rispetto ai frutti controllo
(Ziliotto et al., 2008). Infatti, tra i geni sottoregolati
sono presenti alcuni con funzione a livello di parete
cellulare, inclusi quelli delle endoPG, enzima chiave
nel processo di rammollimento (melting), di pesche e
nettarine. In frutti di avocado trattati con 1-MCP è
stata rilevata una soppressione dell’attività delle PG
che si manifesta per 24 giorni con positivi riflessi sul
mantenimento della consistenza (Jeong e Huber,
2004) ad ulteriore dimostrazione della diversa fisiologia della maturazione che caratterizza le differenti
tipologie di frutto. Questa olefina quindi inibisce i
processi stimolati dall’etilene e, parallelamente, stimola quelli che vengono inibiti dall’ormone, come ad
esempio l’espressione di una EG, una EXP e di endo1,4-β-mannosidasi in nettarina (Lurie et al., 2002;
Ziliotto et al., 2008) e di α-arabinosidasi in pomodoro
(Itai et al., 2003) che sono negativamente regolate
dall’etilene. Considerato che nei processi di rammollimento spesso sono coinvolte famiglie multigeniche
caratterizzate da diversi fattori e meccanismi di regolazione della trascrizione dei singoli membri, l’uso di
questa olefina permette di esaminare in modo più
approfondito il ruolo regolativo dell’etilene, come è
stato fatto ad esempio per le galattosidasi in pera
(Mwaniki et al., 2005), avocado (Tateishi et al., 2007)
e melone (Nishiyama et al., 2007).
Da un punto di vista più strettamente applicativo,
dai numerosi lavori pubblicati emerge che l’uso del
solo trattamento di 1-MCP non risulta essere sempre
sufficiente per indurre un rallentamento marcato della
perdita di consistenza e che in molti casi è importante
affiancare a questa metodica anche altri trattamenti,
come ad esempio l’applicazione di AVG (aminoetossivinilglicina, inibitore della sintesi dell’etilene) in
pesca (Hayama et al., 2008), o la conservazione refrigerata in kiwi e susine (Larrigaudière et al., 2009;
Ilina et al., 2010), o l’uso di atmosfere controllate
durante la conservazione di pere e mele (Fawbush et
al., 2009; Arias et al., 2009).
Metabolismo dei pigmenti
Assieme alla consistenza, il parametro della colorazione è fondamentale per stabilire un determinato
grado di qualità nel frutto, sia dal punto di vista del
consumatore sia da quello del produttore. Infatti, il
viraggio del colore di fondo rappresenta un chiaro
indice dell’evoluzione della maturazione e, per alcune
tipologie di frutto, viene usato come parametro per
stabilire l’epoca di raccolta. Il colore dei frutti dipende dalla presenza di tre principali pigmenti, le cloro-
1-MCP per la fisiologia postraccolta e la maturazione dei frutti
fille, i carotenoidi e i flavonoidi ma può anche essere
influenzato dall’ossidazione dei composti fenolici.
Nonostante il cambio di colorazione sia stato diffusamente analizzato negli studi con 1-MCP, solo parzialmente si è indagato sul metabolismo specifico di ogni
pigmento. Per quanto riguarda la diminuzione del contenuto di clorofilla e il corrispettivo smascheramento
dei pigmenti è stato visto come l’uso dell’1-MCP rallenti questo processo attraverso l’inibizione dell’espressione e dell’azione di clorofillasi e perossidasi
(POX). La degradazione della clorofilla nella pera
giapponese è rallentata dalla conservazione refrigerata
ma il miglior risultato si ottiene combinando il trattamento con 1-MCP e refrigerazione (Itai e Tanahashi,
2008). Il trattamento con 1-MCP rallenta quindi lo
smascheramento dei pigmenti e la degradazione della
clorofilla e ciò può essere molto utile per i prodotti
che mantengono una colorazione verde, ma per molti
altri è importante che questo processo non si arresti
completamente per far si che venga raggiunto il colore
ricercato dal consumatore
L’1-MCP è risultato efficace nel ritardare la sintesi
di carotenoidi in frutti di pesco (Cecchi et al., 2005) e
pomodoro (Moretti et al., 2001). Considerando le
diverse tappe della biosintesi di questa categoria di
pigmenti, è stato visto che, in nettarine, il trattamento
con 1-MCP riduce l’espressione della β-carotene
idrossilasi, responsabile della formazione delle xantofille (Ziliotto et al., 2008). L’analisi dei trascritti via
microarray delle nettarine trattate conferma che alcuni
geni coinvolti nella via biosintetica dei carotenoidi
sono etilene-dipendenti (Trainotti et al., 2006), mentre
altri sono regolati dallo sviluppo così come riportato
anche in albicocca (Marty et al., 2005). In quest’ultimo frutto, l’ espressione della fitoene desaturasi è
ridotta dal trattamento con 1-MCP che non altera,
invece, la trascrizione della licopene ciclasi (Marty et
al., 2005). L’espressione etilene-dipendente della βcarotene idrossilasi è stata osservata anche in arancia,
un’altra specie che accumula xantofille alla maturazione (Rodrigo e Zacarias, 2007), ma non nel pomodoro, dove la β-carotene idrossilasi e la fitoene sintasi
(PSY) sono espresse in modo etilene-indipendente
(Alba et al., 2005).
Per quanto riguarda i flavonoidi è stata rilevata
un’inibizione nell’accumulo delle antocianine nella
buccia dell’uva in seguito al trattamento con 1-MCP
effettuato in campo all’invaiatura (Chervin et al.,
2005) e si ipotizza che questo aspetto sia legato al calo
di accumulo del saccarosio, che in Arabidopsis sembra essere responsabile della induzione della biosintesi
di antocianine (Solfanelli et al., 2006). Un trattamento
con 1-MCP nella fase postraccolta in uve della cv
Aleatico riduce l’aumento di antocianine e polifenoli
indotto da un trattamento con etilene (Bellincontro et
al., 2006). Anche in fragola, altro frutto non-climaterico, è stata rilevata un’inibizione nell’accumulo delle
antocianine a seguito del trattamento con 1-MCP,
mentre ciò non avviene in mele cv Fuji (Mattheis et
al., 2004) ed in pere cv Red d’Anjou (MacLean et al.,
2007). Anche se la concentrazione di flavonoidi non è
modificata nelle pere trattate con 1-MCP, la trascrizione degli enzimi fenilalanina ammonio liasi (PAL) e
calcone sintasi (CHS) è ridotta e ciò indicherebbe che,
in questa specie, la biosintesi di flavonoidi non avviene nella fase post raccolta, quando viene effettuato il
trattamento con 1-MCP.
Gli studi sull’imbrunimento enzimatico sono stati
per lo più condotti in quelle cultivar che possono essere soggette a lavorazioni per preparati di IV gamma.
Infatti i danni fisici prima, durante e dopo il taglio
contribuiscono largamente alla perdita del succo,
all’imbrunimento e al rapido deterioramento del tessuto (Kader, 2002). L’operazione di taglio promuove
molti dei processi indotti dall’etilene (inclusa la sua
stessa biosintesi) e quindi il conseguente uso di 1MCP dovrebbe rallentare il decadimento della qualità.
Nel caso dell’imbrunimento enzimatico, bisogna
innanzitutto considerare il contenuto di substrato (i
composti fenolici) dei vari frutti e il contenuto dell’enzima polifenolossidasi (PPO), responsabile dell’ossidazione del substrato e della formazione di polimeri di colore scuro; in condizioni normali i polifenoli
restano confinati nel vacuolo, mentre in situazioni in
cui l’integrità delle membrane è compromessa entrano
in contatto con l’enzima PPO e danno luogo alla reazione di ossidazione (Franck et al., 2007). Nelle pere
sono presenti grandi differenze nel contenuto dei
composti fenolici all’interno delle varie cultivar che
così rispondono in modo differente all’ossidazione.
Ad esempio, la cv Blanquilla, che ha un contenuto di
composti fenolici superiore di circa cinque volte
rispetto alle cv Conference e Williams, è molto più
suscettibile all’imbrunimento enzimatico. Nel caso del
trattamento con 1-MCP della cv Blanquilla si ottiene
un ritardo dell’imbrunimento enzimatico di circa 5
giorni rispetto al controllo (Arias et al., 2009).
L’imbrunimento enzimatico e la perdita di qualità
visiva in porzioni tagliate di ananas sono ridotti a
seguito di un trattamento con 1-MCP e ciò è dovuto
ad un mantenimento dei livelli endogeni di acido
ascorbico (Budu e Joice, 2003).
Antiossidanti
La relazione tra l’1-MCP e il livello di antiossidanti nel frutto non è ancora stata chiaramente delucidata:
49
Tosetti et al.
in letteratura sono disponibili dati che indicano, come
sopra riportato, che il trattamento con l’olefina riduce
la perdita di acido ascorbico in mango (Budu e Joyce,
2003) mentre in mela (cv Golden Smoothee) dopo un
mese di conservazione all’aria il contenuto di acido
ascorbico nella polpa dei frutti trattati è minore rispetto a quelli controllo (Vilaplana et al., 2006). Nel caso
della cv Empire, invece, è stato rilevato come il contenuto di antiossidanti totale sia lievemente maggiore
nei frutti trattati rispetto al controllo (Fawbush et al.,
2009). In pera, come già accennato, il trattamento con
1-MCP aumenterebbe significativamente la capacità
antiossidante del tessuto, ma il meccanismo con cui
questo avviene resta ancora sconosciuto (Arias et al.,
2009). Da un recente studio svolto in susina (cv Larry
Ann) è stato messo in luce come l’attività dell’enzima
perossidasi (POX) sembrerebbe essere regolata dall’azione dell’etilene, come anche rilevato in avocado
e pesca (Hershkovitz et al., 2005), mentre gli enzimi
superossido dismutasi (SOD) e catalasi (CAT) non
vengono influenzati dall’applicazione di 1-MCP e
risulterebbero quindi essere etilene-indipendenti
(Larrigaudière et al., 2009); dati simili sono stati rilevati anche per le medesime attività enzimatiche in
mela (Vilaplana et al., 2006).
Metabolismo delle sostanze aromatiche
L’etilene è considerato uno dei fattori principali
scatenante lo sviluppo dell’aroma nei frutti climaterici
e i componenti dell’aroma correlati alla maturazione
sono sintetizzati solo quando la sindrome viene
instaurata dalla presenza dell’ormone. L’utilizzo
dell’1-MCP è stato di grande rilevanza per identificare i meccanismi fisiologici legati allo sviluppo degli
aromi e il ruolo dell’etilene nella regolazione della
sintesi dei composti volatili. Durante la maturazione
delle mele gli esteri acetato e butirrato aumentano in
maniera significativa, mentre gli alcoli e le aldeidi
diminuiscono; questo processo però viene bloccato
dall’applicazione di 1-MCP e nei frutti trattati si
riscontra una maggiore quantità di alcoli e aldeidi a
discapito degli esteri (Kondo et al., 2005). Una riduzione degli esteri a seguito di un trattamento con 1MCP è stato anche osservato nella cv Gala (Marin et
al., 2009). Ciò dimostra che l’azione dell’etilene è
necessaria per un adeguato sviluppo dei composti aromatici tipici del frutto maturo. I risultati ottenuti dai
numerosi studi mostrano come vi sia una regolazione
strettamente etilene-dipendente dell’espressione di
geni coinvolti nella produzione di esteri e nella attività dell’enzima alcool acyl-coenzimaA trasferasi sia
in mela (Defilippi et al., 2004) sia in melone (Flores
et al., 2002). In quest’ultimo frutto (tipo Charentais) è
50
stato osservato che l’ultima tappa dell’acetilazione
degli alcoli possiede caratteristiche sia etilene-dipendenti sia etilene-indipendenti, probabilmente attraverso diverse regolazioni delle alcool acetiltransferasi
(Flores et al., 2002). La produzione degli esteri viene
inibita in modo differenziale dall’1-MCP che riduce
maggiormente gli esteri con catena lineare rispetto a
quelli con catena ramificata (Mattheis et al., 2005). In
generale si può affermare che l’applicazione di 1MCP inibisce la produzione di aromi e ne impedisce il
pieno recupero anche dopo il trattamento. In un recente studio svolto su frutti di melo (cv Gala) trattati e
non trattati, è stato notato come il consumatore non
esperto privilegi il mantenimento della consistenza a
discapito delle caratteristiche aromatiche del frutto
(Moya-Leon et al., 2007), mentre coloro che consumano abitualmente frutti di questa varietà preferiscono i frutti non trattati con 1-MCP a causa del calo
delle caratteristiche organolettiche presente in quelli
trattati (Marin et al., 2009).
Effetto dell’1-MCP sull’incidenza di disordini
fisiologici e sulla risposta agli stress
Durante la fase di conservazione dei frutti si possono instaurare cambiamenti fisiologici (fisiopatie)
che provocano più o meno consistenti scadimenti qualitativi o, nei casi più gravi, la completa perdita del
prodotto. Questi cambiamenti, sono in larga misura
indotti, in genotipi suscettibili, da condizioni di conservazione prolungate e/o non appropriate. Oltre alle
fisiopatie, perdite di qualità parziali o dell’intero prodotto sono anche indotte da stress fisici, biotici o meccanici a cui viene sottoposto il frutto durante la fase
postraccolta.
Disordini fisiologici
Riscaldo superficiale. Il riscaldo superficiale si
presenta come un irregolare imbrunimento della buccia ed è causato dalla presenza dei prodotti dell’ossidazione dell’α-farnesene, probabilmente trieni coniugati, che intaccano l’integrità della parete cellulare.
L’incidenza del riscaldo superficiale può essere diminuita con il trattamento con 1-MCP, il quale inibisce
l’induzione etilene-dipendente dell’enzima α-farnesene sintasi (AFS), l’enzima limitante della via di biosintesi dell’α-farnesene. In mela e in pera, l’applicazione dell’1-MCP si è rivelata essere molto utile sia
per cercare di prevenire l’instaurarsi di questa fisiopatia, sia per rallentarne e controllarne lo sviluppo
(Lurie et al., 2005; Itai e Tanahashi, 2008).
Disfacimento interno. Il disfacimento interno è
dovuto, oltre a predisposizione genetica, a diversi fat-
1-MCP per la fisiologia postraccolta e la maturazione dei frutti
tori postraccolta, come, ad esempio, inadeguate condizioni termiche, elevate concentrazioni di CO2 e prolungata conservazione. Questi fattori si sommano ai
normali processi di maturazione e senescenza che
avvengono nei frutti, come, nel caso delle pere, in cui
i frutti che vanno incontro a questa fisiopatia presentano un calo della concentrazione degli antiossidanti
(Franck et al., 2007). In generale è stato osservato che
l’uso dell’1-MCP può prevenire o rallentare l’instaurarsi di processi di deterioramento, se questi sono in
qualche modo controllati (indotti) direttamente o indirettamente dall’etilene. E’ questo il caso delle pere e
delle mele in cui l’1-MCP agisce positivamente sull’inibizione dello sviluppo del disordine fisiologico e
della senescenza in genere (DeLong et al., 2004;
Larrigaudière et al., 2004). Nelle pere della cv Yari
l’inibizione dello sviluppo della fisiopatia esercitata
dall’1-MCP è associata all’attività degli enzimi antiossidanti CAT, SOD e POX (Fu et al., 2007). Poiché
questi disordini fisiologici sono causati da una molteplicità di fattori, spesso i risultati riportati non sono
concordanti ed univoci. E’ questo il caso della mela cv
Empire che, in alcuni studi, sembra aumentare l’incidenza del disfacimento interno a seguito del trattamento con 1-MCP (Watkins, 2008), mentre in altre
varietà non è stato osservato alcun effetto dell’olefina
sul manifestarsi di questo disordine fisiologico
(Fawbush et al., 2009).
Risposta agli stress
Danni da freddo. L’effetto dell’1-MCP rispetto ai
danni da freddo varia in base al comportamento dei
singoli frutti: alcuni rispondono in modo positivo in
seguito all’applicazione dell’olefina e questo è il caso,
ad esempio, di avocado, ananas, pompelmo, clementine, susine, pere (Hershkovitz et al.2005; Selvarajah et
al., 2001; Dou et al., 2005; Larrigaudière et al., 2009).
In avocado il trattamento risulta efficace nella riduzione della comparsa dei sintomi che si sviluppano all’interno del frutto ma non su quelli esterni, ciò suggerisce la presenza di diversi meccanismi di azione dell’etilene sui processi legati alla manifestazione del danno
nei due tessuti (Woolf et al., 2005). La riduzione dei
sintomi del danno da freddo (minore intensità di decolorazione) a seguito di trattamento con 1-MCP in avocado è associato ad una riduzione delle attività delle
PPO e POX (Hershkovitz et al., 2005). Nella susina
l’effetto positivo dell’1-MCP sembra essere dovuto ad
una induzione del processo di coniugazione (malonilazione) dell’ ACC, l’immediato precursore dell’etilene.
A seguito del trattamento con l’olefina si riscontra
infatti un accumulo di M-ACC, con una conseguente
minore disponibilità di ACC per la biosintesi dell’eti-
lene (Larrigaudière et al., 2009). Rispetto ai casi sopra
citati la banana mostra un comportamento diverso: in
seguito ad un trattamento con 1-MCP i danni da freddo infatti si aggravano, mentre per l’arancia non sembra esserci influenza da parte dell’olefina nel manifestarsi dei sintomi del danno (Jiang et al., 2004; Dou et
al., 2005)
Attacco di patogeni. L’etilene agisce come segnale
nelle piante in molti processi legati alla difesa, come
la produzione di fitoalessine e di proteine PR,
(Pathogenesis-Related), l’induzione della via di biosintesi dei fenilpropanoidi e i cambiamenti nella parete cellulare (Diaz et al., 2002). L’etilene inoltre può
stimolare lo sviluppo di necrosi e del meccanismo di
difesa conosciuto come risposta ipersensibile; in quest’ultimo caso il meccanismo di difesa è costituito da
una rapida necrosi nel sito di attacco del patogeno,
indotta da un accumulo di H2O2, che viene seguita
dall’attivazione sistemica di geni connessi con i meccanismi di difesa per limitare la diffusione e la crescita del patogeno (Ciardi et al., 2001; Diaz et al., 2002).
Nel caso di patogeni biotrofi questo tipo di risposta è
sicuramente efficiente, ma nel caso di patogeni emibiotrofi o necrotrofi questa strategia di difesa risulta
altamente inefficace. In base al tipo di patogeno quindi, l’azione inibente dell’1-MCP può dare differenti
risultati nel modulare la risposta ad un attacco.
L’etilene stimola la produzione delle proteine PR, che
non agiscono come difesa dall’infezione, bensì limitano la diffusione del patogeno e agiscono in modi differenti. La comparsa di marciumi su frutti trattati con
1-MCP, come banana e avocado viene spesso associata all’azione inibitoria dell’olefina sui meccanismi di
difesa regolati dall’etilene, ma la comparsa di contaminazioni sembra essere più strettamente collegata
con il prolungato periodo di stoccaggio, che permette
un periodo di crescita più lungo al patogeno piuttosto
che all’azione dell’1-MCP. In fragola è stato però
osservato che la produzione di CO2 stimolata dall’1MCP sia associata con la comparsa di marciumi che è
anche correlata con bassi livelli di composti fenolici
(Jiang et al., 2001). Alte concentrazioni di 1-MCP
accelerano lo sviluppo di marciumi in alcune cultivar
di clementina, arancio e pompelmo (Dou et al., 2005).
In letteratura sono anche riportati, tuttavia, casi di
effetti positivi dell’1-MCP nel controllo dello sviluppo di patogeni. Nelle pere il trattamento riduce l’incidenza della senescenza precoce e il decadimento
(Calvo, 2003) ed effetti positivi sono anche stati
osservati nelle pesche (Liu et al., 2005). In quest’ultima tipologia di frutto, l’1-MCP stimola l’attività di
PPO, PAL e POX in frutti inoculati con P. expansum.
Sulla base della letteratura pubblicata sull’argomento,
51
Tosetti et al.
risulta evidente che gli effetti dell’1-MCP sulla incidenza degli attacchi di patogeni possono variare,
anche per la stessa tipologia di frutto, in relazione alle
concentrazioni usate e alle differenze nel protocollo
sperimentale utilizzato
Ferite. Pochi sono i dati disponibili relativi a possibili effetti dell’1-MCP sui processi indotti da stress
da ferita. Il trattamento con 1-MCP in lattuga induce
un calo dei composti fenolici e la conseguente decolorazione del tessuto, ma non interferisce con l’accumulo di composti fenolici indotto da ferita. Questo fatto
dimostrerebbe come il danno da ferita e l’etilene agiscano indipendentemente nell’induzione del metabolismo dei fenilpropanoidi e nell’accumulo di composti
fenolici (Dou et al., 2005).
Prospettive future
Gli studi effettuati sull’azione dell’1-MCP hanno
messo in luce come vi sia una grande variabilità nelle
risposte al trattamento in base al tipo di frutto e alla
cultivar in esame. L’utilizzo dell’1-MCP, o l’accoppiamento di questa tecnologia ad altre metodiche di
conservazione, permette in alcuni casi di ottenere dei
benefici in termini di durata della conservazione e
mantenimento della qualità del frutto, mentre in altri
casi i benefici ricavabili sono minori. I risultati che talvolta appaiono contraddittori stanno ad indicare quanto ancora sia scarsa la nostra conoscenza di alcuni
meccanismi di base che regolano la maturazione dei
frutti. E’ quindi necessario un approfondimento delle
conoscenze relative alla interazione dei fattori che
possono modulare ed ottimizzare l’ effetto dell’applicazione pratica dell’1-MCP, ma anche del suo utilizzo
come strumento per studi fisiologici (concentrazioni,
durata del trattamento, stadio fisiologico dei frutti da
trattare). Questa olefina rappresenta, ancora di più in
una realtà di ricerca scientifica che si dota sempre più
rapidamente di approcci e tecniche di indagine avanzate, un elemento chiave per la delucidazione del
ruolo dell’etilene in campo vegetale e non solo nel settore del postraccolta. Bisogna però ricordare che, ad
oggi, negli studi svolti sull’1-MCP ci si è concentrati
particolarmente su alcuni aspetti, quale ad esempio il
mantenimento della consistenza, mentre rimangono
ancora da indagare più approfonditamente ed in dettaglio gli altri processi fisiologici del frutto responsabili
delle variazioni di molti dei parametri qualitativi utilizzati nella catena di commercializzazione.
Riassunto
L’1-metilciclopropene (1-MCP) è un’olefina in
52
grado di competere per i siti recettoriali dell’etilene ed
è diffusamente utilizzato per prolungare la conservazione di alcune tipologie di frutto. Grazie al suo meccanismo di azione, l’1-MCP è stato ampiamente utilizzato anche per studiare aspetti della fisiologia
postraccolta e la regolazione di processi tipici della
maturazione di frutti climaterici e non-climaterici. Le
ricerche condotte hanno consentito di chiarire meglio
il ruolo dell’etilene nel controllo e nella regolazione
di meccanismi coinvolti nella biosintesi e trasduzione
del segnale dell’ormone, nel rammollimento della
polpa, nel cambio di pigmentazione, nello sviluppo
degli aromi, nel metabolismo dei composti antiossidanti e nella incidenza di fisiopatie di conservazione.
Parole chiave: antiossidanti, aromi, consistenza, etilene, fisiopatie, pigmentazione, recettori.
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