Cinetica Enzimatica
• Fattori che influenzano le velocità
• Substrato, prodotto, inibitore, attivatore, pH, forza
ionica, temperatura
• Analisi al variare dei fattori
• Meccanismo cinetico di catalisi
• Ipotesi sul complesso e sull’intermedio
• Costanti cinetiche – concentraz. fisiologiche
• Regolazione
• Gruppi coinvolti
• Modello per la reazione
ENZIMI
SONO PROTEINE CON PESO
MOLECOLARE CHE VARIA DA 12.000
FINO A OLTRE UN MILIONE
UNICA ECCEZIONE ALCUNI RNA CATALITICI
ALCUNI HANNO BISOGNO DI COFATTORI – GRUPPO PROSTETICO :
-IONI INORGANICI Fe2+ , Mg2+ , Mn2+ , Zn2+ , . . . .
-MOLECOLE ORGANICHE - COENZIMI
Alcuni enzimi che contengono
come cofattori elementi inorganici
Fe2+ o Fe3+
Citocromo ossidasi
Catalasi
Perossidasi
Cu2+
Citocromo ossidasi
Zn2+
Anidrasi carbonica
Alcol deidrogenasi
Mg2+
Esochinasi
Glucosio-6-fosfatasi
Piruvato chinasi
Mn2+
Arginasi
Ribonucleotide reduttasi
K+
Piruvato kinasi
Ni2+
Ureasi
Mo
Dinitrogenasi
Se
Glutatione perossidasi
Alcuni coenzimi servono come trasportatori
temporanei di specifici atomi o gruppi funzionali
Coenzima
Esempi di gruppi chimici
trasferiti
Precursore nella dieta dei
mammiferi
Tiamina pirofospato
Aldeidi
Tiamina (vitamina B1)
Flavin adenin dinucleotide
Elettroni
Riboflavina (vitamina B2)
Nicotinamide adenina
dinucleotide
Ione idruro (:H-)
Acido nicotinico (niacina)
Coenzima A
Gruppi acilici
Acido pantotenico e altre
molecole
Piridossal fosfato
Gruppi amminici
Piridossina (vitamina B6)
5’-deossiadenosilcobalamina (coenzima B12)
Atomi di H e gruppi alchilici
Vitamina B12
Biocitina
CO2
Biotina
Tetraidrofolato
Gruppi a un atomo di
carbonio
Folato
Acido lipoico
Elettroni e gruppi alcilici
Non necessario nella dieta
• Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi coenzimi o ioni
metallici va sotto il nome di OLOENZIMA
• La parte proteica di un enzima viene detta
APOENZIMA o
APOPROTEINA
Classificazione internazionale degli enzimi
N.
Classe
Tipo di reazione catalizzata
1 - Ossidoreduttasi
Trasferimento di elettroni
2 - Trasferasi
Reazioni di trasferimento di gruppi
3 - Idrolasi
Reazioni di idrolisi (trasferimento di gruppi funzionali all’acqua)
4 - Liasi
Addizione di gruppi a legami doppi o formazione di doppi
legami mediante la rimozione di gruppi
5 - Isomerasi
Trasferimento di gruppi all’interno di molecole formando
isomeri
6 - Ligasi
Formazione di legami C-C, C-S, C-O, C-N mediante reazioni di
condensazione accoppiata alla scissione di ATP
Legame di un substrato al sito
attivo di un enzima
Substrato
Residui importanti
Del sito catalitico
Diagramma della coordinata di
reazione per una reazione chimica
Energia libera, G
Stato di transizione (‡)
DG‡
S
P
DGP‡
S
Stato
basale
S
DG°’
P
Stato
basale
Coordinata della reazione
N.B.:Nei sistemi biologici la variazione di energia libera standard è calcolata a pH 7,0
La relazione tra K’eq e DG°’
DG°’ = - RT ln(K’eq)
K’eq
DG°’ (kJ/mole)
10-6
34,2
10-5
28,5
10-4
22,8
10-3
17,1
10-2
11,4
10-1
5,7
1
0
101
-5,7
102
-11,4
103
-17,1
Diagramma della coordinata di reazione della reazione
S  P non catalizzata e catalizzata da un enzima
Energia libera, G
Stato di transizione (‡)
‡
DGnon
cat.
‡
‡
DGcat.
S
ES
EP
P
Coordinata della reazione
E+S
ES
EP
E+P
L’aumento della velocità prodotto da alcuni enzimi
Anidrasi carbonica
107
Fosfoglucomutasi
1012
Succinil-CoA-trasferasi
1013
Ureasi
1014
Energia di legame, che si libera
dalle interazioni enzima-substrato
Gruppi catalitici specifici contribuiscono alla catalisi
• Catalisi acido-basica
generale
• Catalisi covalente
• Catalisi da ioni
metallici
Prima tappa della razione catalizzata dalla
Chimitripsina, tappa di acilazione
Cinetica Enzimatica
• Fattori che influenzano le velocità
• Substrato, prodotto, inibitore, attivatore, pH, forza
ionica, temperatura
• Analisi al variare dei fattori
• Meccanismo cinetico di catalisi
• Ipotesi sul complesso e sull’intermedio
• Costanti cinetiche – concentraz. fisiologiche
• Regolazione
• Gruppi coinvolti
• Modello per la reazione
Reazioni catalizzate da enzimi
v = velocità iniziali di reazione
v
v
senza enzima (catalizzatore)
con enzima (catalizzatore)
[S]
[S]
S
k1
k -1
P
v
d [P]
 k 1[S]
dt
v  f ([S ]) ?
[P]
4[E]
3[E]
2[E]
v=[P]/t1
Reazioni catalizzate da enzimi
[E]
t1
t2
[E]
Tempo di saggio
S
k1
k -1
P
Formazione del complesso enzima substrato
S
S
P
S
S
ER
S
S
S
S
ER
P
ER
S
S
S
k1
E+S
k2
ES
k-1
k3
EP
k-2
E+P
k-3
ER
Approccio del rapido
equilibrio
in un sistema ad un substrato
k1
E+S
k2
ES
k-1
k3
EP
k-2
k1
E+S
k-3
k2
ES
E+P
k-1
k-2
k1
k2
E+S
ES
k-1
E+P
E+P
k1
E+S
k2
ES
E+P
[ES] 
[E]  [S]
KS
k-1
[E]  [S]
v
Ks

[ET ] [E]  [E]  [S]
Ks
k2
v  k 2  [ES]
[ET ]  [E]  [ES]
KS 
k  1 [E]  [S]

k1
[ES]
[S]
v
 Ks
k 2  [ET ] 1  [S]
Ks
Equazione di Henri-Michaelis-Menten
v
k 2  [ES]

[ET ] [E]  [ES]
v
[S]

V max Ks  [S]
APROCCIO DELLO STATO STAZIONARIO
k1
E+S
k2
ES
E+P
[S]
v
 Km
k 2[ET ] 1  [S]
Km
v
[S]

V max Km  [S]
k-1
Vmax
v  k 2  [ES]
v
[ET ]  [E]  [ES]
1.0
\\
0.8
0.6
v
k 2  [ES]

[ET ] [E]  [ES]
0.5 Vmax 0.4
0.2
d [ES]
 k 1  [E][S]  k  1[ES]  k 2[ES]  0
dt
[ES] 
k 1[S]
 [E]
( k  1  k 2)
Km 
[ES] 
k 1 k2
k1
[S]
[E]
v
K
m

[ET ] [E]  [S] [E]
Km
k2
[S]
 [E]
Km
\\
0.0
0
2
4
6
8
10
100
[S]
Km
1
Km 1
1



v V max [S] V max
Grafico dei doppi reciproci
8
1/v 7
6
5
4
1/Vmax 3
2
1
0
-2
0
2
4
6
-1/Km
1/[S]
8
Enzimi multisubstrato
E+A
+
B
EA
+
B
EP
+
Q
EB + A
EAB
EPQ
EA
A + E + Q
P+E
+
Q
P + EQ
EQ
Meccanismo sequenziale
A
E
B
EA
E
P + E* + B
E*B
EAB
EPQ
Q
EQ
E
Meccanismo PING PONG
A
E*P
P
P
EA
B
E*
Q
EQ
E
INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitore competitivo
k1
k2
E+S
+I
ES
Inibitore incompetitivo
E+P
E+S
k-1
k1
k-1
KI
ES
k2
+I
KI
EI
ESI
Inibitore non competitivo
E+S
+I
k1
k-1
ES
+I
KI
KI
EI + S
k2
k1
k-1
ESI
E+P
E+P
Formazione del complesso enzima
inibitore competitivo
I
S
P
S
I
ER
S
S I
S
I
ER
S
ER
P
ER
ER
Formazione del complesso enzima
inibitore non competitivo
I
S
P
S
I
ER
S
S
ER
S
ER
S I
S
ER
I
I
P
ER
ER
Formazione del complesso enzima
inibitore incompetitivo
I
S
P
S
I
S
ER
S
ER
S
ER
S I
S
I
P
ER
ER
INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitore competitivo
k1
k2
E+S
ES
Inibitore non competitivo
E+P
k-1
+I
k1
E+S
k-1
+I
KI
ES
EI+S
E+P
E+S
k1
k1
k-1
+I
KI
EI
k2
Inibitore incompetitivo
k2
ES
E+P
+I
KI
KI
ESI
ESI
k-1
1/v
I =KI
8
I aumenta
I aumenta
1/v
I =0
6
8
1/v
I =0
6
1/Vmaxapp
4
8
I =0
6
1/Vmaxapp
4
4
1/Vmax
2
-2
2
0
2
-1/Km app. 1/[S]
4
6
8
-2
2
0
-1/Km
2
1/[S]
4
6
8
-2
-1/Km app.
0
2
1/[S]
4
6
Regolazione dell’attività enzimatica
- Enzimi allosterici k1
ET
S
k2
E + nS
ET
E(S)n
E + nP
k-1
S
ER
v
[ S ]n

V max K '[ S ] n
ET
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
S
ER
ER
S
S
ER
ER
S
2
4
6
8
10
ER
ET
EETT
ER
EET T
ER
ER
ET
ER
ET
S
EETT
S
EET T
ER
ER
ER
ET
ER
ET
S
E
ETT
EET T
S
S
ER
ER S
ER
ET
ET
S
E
ETT
ER
EET T
S
S
ER
ER
ET
S
S
S
ER S
S
S
ET
ER
E
ETT
EET T
ET
S
S
S
ER
ER S
ER
S
Aspartato transcarbamilasi
(ATCasi)
Effetto del pH sulle attività
enzimatiche e sulla stabilità
1
v
0.5
pKa1
pKa2
0
3
4
5
6
7
pH
8
Effetto della temperatura sulle
attività enzimatiche e sulla stabilità
v
V max  k 2  [ET ]
k  Ae

Ea
RT
10
20
30
40
50
60
Temp. (°C)
Effetto della temperatura
Equazione di Arrhenius - energia di attivazione
logk
pendenza  
k  Ae
Ea

RT
log k  
Ea 1
  log A
2.3  R T
Ea
2.3  R
1
T