Spettroscopie biologiche
•Tecniche di assorbimento
–IR
–UV-Vis
–Dicroismo circolare
–Assorbimento atomico
•Tecniche di emissione
–Fluorescenza
–Emissione atomica
•Tecniche di diffusione
–Light scattering
–Raman
–Resonance raman
Spettroscopia vibrazionale (IR)
IR transparent Salt Plates
Light Path
(shown by red line)
Spettroscopia UV-Vis
E
s
hn
p*
n
p
s
p
n
p*
p*
C=C (p-p*) 62 000 cm-1 160 nm
H2O (n-p*) 60 000 cm-1 167 nm
C=O (n-p*) 34 000 cm-1 295 nm
Orbitali di Frontiera
HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital
LUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital
Spettro di assorbimento della clorofilla:
Sono visibili due transizioni principali
a 670 nm (rosso) e 430 nm (blu).
ecc
I0(n)
l
I0(n)
fond
Legge di Lambert-Beer:
I(n)
C =concentrazione
I 0 (n 


A(n   log 

(

I
n


A(n    (n lC
Cromofori nelle proteine
Il legame peptidico
(210 nm)
Ponte disolfuro
(250 nm)
Centrato a 280 nm
Dicroismo circolare (CD)
Cromofori in ambienti asimmetrici assorbono in
modo diverso radiazioni polarizzate circolarmente
in senso opposto
Ellitticità in relazione alla legge di Lambert-Beer
A = Al - Ar = llc - rlc =  lc
[] = 3298 ∆
• Legame peptidico (180 - 250 nm)
• Residui aromatici (250 - 350 nm)
Curve di denaturazione termica di proteine
Fluorescenza
Spettrofotofluorimetro
Campione
Io λ1
Sorgente
Monocromatori
Luce emessa, λ2
Detector
Spettri di eccitazione e spettri di emissione
Typical result:
Nuclease
Folded protein
Unfolded protein
FRET