ENZIMI
Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di
agire indipendentemente da esse
Determinano tutti i processi di degradazione,
sintesi, trasformazione e conservazione
dell’energia nella formazione ed evoluzione della
materia vivente.
Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o
molecola organica
CATALISI
⇓
legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e
disposizione residua individua una tasca detta SITO
ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa
della proteina per la sua funzione catalitica.
DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA
NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA
Complementarità geometrica e fisica tra un E ed un substrato
dipendente da forze non covalenti
CATALISI OMOGENEA
CATALISI ETEROGENEA
sub. e cat. nella stessa fase
sub. e cat. in fasi diverse
Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale
intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi).
Struttura tridimenzionale dell’E
fondamentale per la
conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di
reazione.
SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON
IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni
dell’enzima).
Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica.
Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi
proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da
enzima.
PM enzimi = da 12000 a 106
Molecola su cui opera l’enzima = substrato
DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO
Apoenzima(denaturato con cal.)
+
cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento)
⇓
Enzima completo
(oleoenzima)
Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere
ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole
organiche (coenzimi) che possono essere:


legati debolmente alla proteina
legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)
ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato
modificato nella reazione e dissociato)
NAD+ e NADP+ ⇒ coenzimi nucleotidici piridinici
associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di
un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella
forma ridotta con rilascio di H+
Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido pantotenico
è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH3COAltri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A,
D, E e K.
Enzimi identificati da 4 numeri:
1. Appartenenti a una delle classi relative alla
reazione catalizzata
2. Appartenenza ad una sottoclasse
3. Appartenenza ad una sottosottoclasse
4. Posizione progressiva nella sottosottoclasse
Esempio
ATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfato
Catalizzatore esochinasi (nome comune) o
ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il
trasferimento del P da ATP a glucosio).
Numero dell’enzima 2.7.1.1.
2. classe delle transferasi
7. sottoclasse fosfotransferasi
1. sottosottoclasse fosfotransferasi con OH
come gruppo accettore
1.glucosio come accettore del gruppo
fosforico.
Enzima Chirale
riesce a distinguere tra gruppi della
molecola stericamente non equivalenti.
Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi
stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno
solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici)
SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI
Un enzima può avere diversi gradi di specificità:
Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa
specificità)
Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di
gruppo)
Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che
le unisce (specificità assoluta).
Es.
A-B + H2O = AOH + BH
•la natura di A e B non è importante
•A o B devono essere determinate
•A e B devono essere del tipo appropriato.
Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa
può operare sugli a-glucosidi cioè sul glucosio
legato con legame a-glucosidico ad un altro
zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).
Meccanismo reazione enzimatica
Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica
del complesso attivato e/o + corretto orientamento
geometrico per la formazione del complesso attivato
E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non
alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati
(specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono
gruppi funzionali che:
•Reagiscono temporaneamente con S
•Predispongono S a formare P
I gruppi catalitici di E interagendo con S lo
preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea.
Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la
cui energia di legame serve per:
Compensare la riduzione dell’entropia
(avvicinamento e orientamento substrato)
desolvatare il substrato
indurre binding produttivo o adattamento indotto
Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi
e la specificità.
DIVERSI TIPI DI CATALISI
Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se
dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene
laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula)
Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato
stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.
Meccanismo catalisi enzimatica
Andamento cinetico
Il sito attivo
Cinetica Enzimatica
La velocità iniziale di una reazione
aumenta quasi linearmente all'aumentare
della concentrazione di substrato.
Vo
La
velocità
è
direttamente
proporzionale alla concentrazione
del substrato e la reazione è di
primo ordine V = k [S]
[S]
Cinetica Enzimatica
La proporzionalità fra V e [S]
progressivamente diminuisce.
Vmax
V
La
velocità
iniziale
diventa
indipendente
dalla [substrato] e la
reazione è di ordine zero
rispetto al substrato.
[S]
La costante di Michaelis (KM)
kM kM
affinità
kM kM
kM kM
kM
Effetti della concentrazione dell’enzima
Vmax è direttamente proporzionale alla [E]
Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]
Unità Internazionale
la quantità di enzima che catalizza la
formazione di una micromole di prodotto
in un minuto
kcat o numero di turnover
il numero di molecole di substrato convertite in prodotto
nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è
saturata con il substrato.
E+S
k1
k-1
kcat = k2
kcat
ES
k2
E+P
Vmax = kcat [ET]
kcat kcat
kcat kcat kcat
efficienza catalitica
Enzima
catalasi
kcat
40 000 000
anidrasi carbonica
1 000 000
acetilcolinesterasi
14 000
lattato deidrogenasi
chimotripsina
1 000
100
DNA polimerasi
15
lisozima
0,5
1
1
KM  1 
 


V Vmax Vmax  [S] 
Che cosa influenza la velocità della reazione?
Pepsina
Chimotripsina
pH
Velocità di reazione
TEMPERATURA
Velocità di reazione
Tripsina
pH
Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi:
Temperatura, °C
•si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima
La velocità
aumenta all’aumentare
di T,
ma nella
•si può modificare
la ionizzazione
di S influenzando
il legame
EScatalisi enzimatica un
aumentoladi
T può portare
admodificandone
una variazione
di conformazione
con perdita
•si può modificare
ionizzazione
dell’E
l’affinità
per S
•si può modificare
la ionizzazione
la ionizzazione
delsolito
complesso
conseguente
dell’attività
catalitica. Di
si ha ES
un max di attività tra 40°C e
Gli effetti 260°C
e 3 influenzano
la KM il 4completa
la Vmax. a 90-95 °C.
e la denaturazione
Influenza della temperatura
Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di
Arrenius
K=A e-Ea/RT
dalla cui linearizzazione si possono calcolare:
Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate)
Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità
quando T aumenta di 10°C.
Reazioni non catalizzate Q10= 2
Reazioni catalizzate
1<Q10< 2
Influenza del pH
Andamento variabile con uno o più massimi di attività a
diversi pH. A pH estremi:
•si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima
•si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame
ES
•si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone
l’affinità per S
•si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del
complesso ES
Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.
REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI
Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti
affinchè si abbia la liberazione di prodotti
Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano
stati legati.
S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione
liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo
substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma
originaria.
SISTEMI MULTIENZIMATICI
Reagiscono in una serie consecutiva di reazioni in cui P
diventa S della reazione successiva (azione concertata da
2 a 20 E di reazioni in sequenza).
Sistemi multienzimatici in fase solubile (glicolisi)
Sistemi multienzimatici fisicamente associati con
ridotti problemi di diffusione (ac. grasso sintetasi)
Sistemi associati a membrane o ribosomi (complessi
della catena respiratoria)
Inibitori enzimatici
Irreversibili
Reversibili
INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione
L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami:
Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si
ripristina l’attività di E
Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami
covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.
INIBIZIONE REVERSIBILE
Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E
Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax
Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal
sito attivo.
Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM
Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES.
E + S  ES  E+P;
ES+I  ESI
Si modificano entrambe le costanti cinetiche.
Inibizione Competitiva
Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo
mutuamente escludenti
Un inibitore competitivo
ridurrà l'affinità enzima
substrato, cioè aumenterà
il valore di Km.
Ad alte concentrazioni di
substrato la reazione non
viene rallentata e Vmax è
sempre la stessa.
Inibizione non-competitiva
Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione
mutuamente escludenti
Inibizione incompetitiva
Il substrato non viene più convertito in prodotto
La KM rimane invariata
La Vmax diminuisce
I
Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un
gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività
catalitica.
Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo
che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica
normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di
reazione diventando composti molto reattivi che si legano
irreversibilmente all’enzima.
Inibizione da prodotto = prodotto che compete con il S al
sito attivo formando EP.
ATTIVITA’ ENZIMATICA = misura della variazione di
concentrazione di reagente o prodotto nel tempo. Misurata in unità
di attività (UA) come la quantità di E utile per trasformare una
micromole di S in P al minuto (a pH e [S] ottimali).
Attività specifica =unità di enzima per mg di proteina (maggiore
quanto maggiore è la purezza dell’enzima).
Attività molecolare =unità per micromole di E alla [S] ottimale,
cioè il numero di molecole di substrato trasformate per minuto per
molecola di enzima
Unità di misura in katal = quantità di E che trasforma una mole di S
al secondo (si usano i sottomultipli come microkatal o nanokatal).
Per l’attività specifica katal/kg di proteina.
DOSAGGIO ATTIVITA’ ENZIMATICA
Attività enzimatica dipendente da : T, pH, con. substrato, conc.
cofattori.
Le misure di attività vanno fatte in condizioni definite e
controllate.
Si sceglie una conc. di substrato saturante ([S] >10KM) dopo
aver calcolato dalla Michaelis-Menten i valori di KM e Vmax.
La misura della velocità iniziale Vo a pH e T ottimali dipende
solo dalla [E].
Si aggiungono gli eventuali cofattori indispensabili per la
catalisi.
La commissione internazionale ha suggerito di usare la
T=25°C e nei paesi tropicali 37°C.
I metodi analitici più usati per il dosaggio misurano
l’assorbanza del S o preferibilmente P nel tempo.
Accanto ai dosaggi ottici esistono metodi fluorimetrici,
manometrici, polarografici o radioattivi per dosare
l’attività enzimatica.
L’attività specifica è più utile di quella totale se si
desiderano seguire le fasi di purificazione dell’E da una
matrice reale.
specificità
substrati
reazioni
complementarietà strutturale
mutuo riconoscimento
modulazione dell’attività
quantità di proteina enzimatica
regolazione
REGOLAZIONE E CONTROLLO DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
Enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta
di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo
sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva
catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore).
In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima
regolatore.
Regolazione:
1.Allosterica (azione mediante altra forma assunta per il legame
reversibile con un metabolita regolatore detto modulatore).
2.Modificazione da legame covalente (gruppi chimici modificanti AMP,
P, gruppi metili legati covalentemente all’E)
Queste due classi di enzimi sono proteine a struttura quaternaria che
spesso non ha sulla stessa subunità sito attivo e sito regolatore.
Quando il substrato si comporta da modulatore l’enzima è detto
omotropico se si tratta di molecola diversa eterotropico.
Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con
andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto
a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.
Regolazione della
glicogeno fosforilasi
mediante modificazioni
covalenti
MECCANISMI DI INDUZIONE E REPRESSIONE
Regolazione della produzione  concentrazione di E
Meccanismi di sintesi proteica rispetto alla produzione di E nelle
diverse condizioni metaboliche:
1. Enzimi costitutivi= prodotti a v costante (C costante)
indipendentemente dallo stato metabolico dell’organismo 
permanentemente presenti nella cellula
2. Enzimi inducibili = prodotti in c.n. in piccolissime quantità, ma
con produzione aumentata in risposta a speciali sostanze (es. bgalattosidasi per E. coli)
La repressione può essere indotta da particolari sostanze che fanno
scomparire dal corredo enzimatico alcuni enzimi coinvolti nella
sintesi dell’E in questione
Interessano i processi di sintesi proteica e coinvolgono fenomeni a
livello genetico e sono esempi di risparmio energetico
.
ZIMOGENI= PRECURSORI INATTIVI DI MOLTI
ENZIMI
La loro attivazione avviene con scissione proteolitica di una
parte di essi (es.chimotripsina e tripsina)
ISOENZIMI= FORME MULTIPLE DI ENZIMI CHE
DIFFERISCONO IN COMPOSIZIONE DI a.a.
Catalizzano la stessa reazione con diversa cinetica (Km e
Vmax) come la lattico deidrogenasi (5 isoenzimi)
ENZIMI NEL TERRENO
Sono prevalentemente liberi ed extracellulari e possono rimanere
stabili ed attivi per migliaia di anni.
Nel suolo esiste attività catalitica inorganica ed enzimatica, ma
quest’ultima è molto più efficiente e eliminabile con
trattamenti termici energici (110-150 °C per 15-30 h per una
distruzione totale)
Due grandi categorie
1. E cellule proliferanti
2. E accumulati (liberi o immobilizzati)
Per distinguere tra gli accumulati e i proliferanti può usare un
agente sterilizzante (toluene o ossido di etilene o radiazioni
UV) che estinguono l’attività microbica, ma non modificano
quella degli esoenzimi.
Nel suolo 4 classi di E:
•Ossidoreduttasi
•Idrolasi
•Liasi
•Transferasi
La prime due sono predominanti
Polisaccaridasi e proteinasi (idrolasi) demoliscono macromolecole
come carboidrati e proteine e sono essenziali per i cicli biologici di
C e N.
Fosfatasi e solfatasi (idrolasi extracellulari) producono P e S
nutrienti per le piante. Altre idrolasi demoliscono fitofarmaci e
xenobiotici.
Deidrogenasi (ossidoreduttasi intracellulari) danno informazioni
sull’attività biologica delle popolazioni microbiche.
E del suolo usati come indicatori di fertilità
Nel suolo c’è una correlazione tra sostanze umiche e attività
enzimatiche ( attività esterasica prop. al contenuto di S.O.)
Le attività enzimatiche decrescono nel profilo del terreno più
rapidamente della S.O.
L’attività degli enzimi nel terreno riguarda alcune delle più
importanti trasformazioni nel ciclo di C, N, P, S.
Il terreno ad es. contiene ureasi (da animali attraverso il ciclo
dell’urea), che condiziona la fertilizzazione ureasica.
Le attività enzimatiche nel suolo possono essere considerate come
indici di fertilità.Ogni tipo di terreno può essere caratterizzato per
il suo patrimonio in attività enzimatica, che si mostra efficiente
anche quando le condizioni ambientali sono proibitive per i
microorganismi e, in casi limite, può aiutare la ripresa vegetativa
per la piante e l’avvio delle attività microbiche col ripristino delle
condizioni favorevoli.
ENZIMI IMMOBILIZZATI
Nel terreno esistono attività enzimatiche extracellulari associate a
costituenti colloidali organici (humus) ed inorganici (argille e
ossidi) del suolo. Gli E vengono trasformati da catalizzatori
omogenei in eterogenei.
L’immobilizzazione di un enzima comporta una diminuzione dei
gradi di libertà rispetto ed E libero. Tuttavia in vari settori
farmaceutici ed industriali gli E immobilizzati risultano efficienti
catalizzatori specifici eterogenei.
E immobilizzato:
•Può essere riusato
•Può essere usato in processi continui
•Può presentare minor sensibilità ad agenti disattivanti
•Può essere preparato per usi particolari
Effetti dell’immobilizzazione
Svantaggi
 -Cambi di conformazione che possono rendere il sito attivo meno
accessibile
 -Riduzione della concentrazione effettiva dell’enzima
 -Effetti microambientali di diversità di intorno del sito attivo
rispetto alla soluzione
E immobilizzato ha una più alta Km, diversa specificità di substrato,
diverso optimum di pH e T.
Vantaggi
 Maggiore resistenza termica
 Maggiore resistenza proteolitica, agli inibitori ed ai Me pesanti
 Possibilità di riutilizzo + volte con separazione ed allontanamento
dei prodotti di reazione.
Le conoscenze sugli E immobilizzati ha
consentito applicazioni tecnologiche e
preparazione di modelli simulando sistemi reali in
piante, terreno e acque per interpretare
osservazioni sperimentali e migliorare le
conoscenze di base.
E di sistemi multienzimatici, specie se associati a
membrane cellulari possono essere considerati
esempi di enzimi immobilizzati che operano su
sistemi viventi.
INTERAZIONI TRA E DEL SUOLO E RESIDUI
FITOFARMACI
Dipendono da
·
·
·
·
Natura e dose del composto
Tipo di enzima
Tipo di terreno
Condizioni ambientali
Si possono avere tre situazioni:
•1. Attività enz. aumenta dopo il trattamento (prodotto usato da
alcune classi di microorg.)
•2. Attività enz. inalterata (terreno biologicamente morto può
conservare attività enz.)
•3. Attività enz. ridotta o annullata dal trattamento (conseguenze
agronomiche serie)
Le tre situazioni possono verificarsi contemporaneamente per le
diverse attività enzimatiche. Anche operando solo su alcuni enzimi
un erbicida può alterare l’equilibrio del corredo enzimatico del suolo
con riflessi più o meno pronunciati su tutto l’ecosistema.