ESERCITAZIONI 2009
APPLICAZIONI DI GENETICA
UMANA E MOLECOLARE
1.
Quantizzazione delle proteine
2.
Applicazioni delle proteine di fusione
1. Quantizzazione delle proteine tramite
reattivo di Bradford
OCH 2CH 3
Coomassie Brilliant Blu R
HN
N
SO3Na
N+
SO3Na
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante
da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)
Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di
Bradford
•
Il colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine
tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e
tramite forze di van der Waals
•
Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico
•
Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in
cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a 595
nm
• La quantità di colorante che si lega è
proporzionale alla quantità di
proteina
presente in soluzione, pertanto l’intensità
del colore blu (e dunque l’assorbimento) è
proporzionale alla concentrazione proteica.
N.B. Il saggio è indipendente dal tipo di
proteina
Quantità di proteina
Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di
Bradford
VANTAGGI
• Semplicità di preparazione del reattivo
• Sviluppo del colore immediato
• Stabilità del complesso
• Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)
• Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,degli
agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti
come sodio azide
SVANTAGGI
• Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere
• La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal
contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno
standard
• Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida
APPLICAZIONI DELLE
PROTEINE DI FUSIONE
Saggi di Doppio Ibrido
Saggi di cPull-Down
Proteina di fusione
Proteina Tag
Saggi di legame
Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina
1. Pull-Down
Proteina di fusione
ESCA
Proteina A
?
Proteina B
PREDA
Tag Proteina A
ESCA
Estratto proteico cellulare
J
W
Z
Y
Proteina B
PREDA
X
Pull-Down
1.
2.
3.
4.
Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina)
Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina
Glutatione)
Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della
purificazione
Preparare gli estratti cellulari eucariotici che
contengono la proteina d’interesse
Pull-Down
ESPERIMENTO
CONTROLLO
Resina GST Esca
X
Preda
Y
Z
Resina GST
J
Estratto cellulare
lavaggi
Resina GST Esca Preda
X
Preda
Y
Z
J
Estratto cellulare
lavaggi
Resina GST
X
Preda
Z
Pull-Down
Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
TRASFERIMENTO
SDS-PAGE
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
BLOCKING
ANTICORPO
PRIMARIO
SVILUPPO
ANTICORPO
SECONDARIO
Pull-Down: Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
X
Preda Y
ZJ
Resina GST
Resina GST Esca Preda
MK INPUT CO ESP
La nostra proteina
d’interesse è stata legata
dalla proteina di fusione!
Il controllo è pulito
Pull-Down
LIMITI DEL SAGGIO:
• Necessità di controlli negativi, presenza di legami
aspecifici alla resina.
• Interazioni deboli o transienti potrebbero non essere
rilevate.
• La presenza del tag potrebbe interferire con il
legame.
• E’ un sistema forzato che potrebbe non rispecchiare
l’effettiva situazione biologica.
APPLICAZIONI DELLE
PROTEINE DI FUSIONE
Saggi di Doppio Ibrido
Saggi di Pull-Down
Proteina di fusione
Proteina Tag
Saggi di legame
Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina
2. Sistema del Doppio Ibrido
•
Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere
organizzati funzionalmente in domini distinti:
1. Il dominio legante il DNA (DBD)
2. Il dominio di transattivazione (AD)
AD
DBD
Sistema del Doppio Ibrido
• I domini proteici sono normalmente identificati a
classificati in base alle loro caratteristiche
strutturali, funzionali e legate all’evoluzione.
• Un dominio può quindi essere descritto come un’unità
strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata
durante l’evoluzione e in grado di funzionare
indipendentemente dal contesto a cui appartiene la
proteina.
Sistema del Doppio Ibrido
Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una
proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo
che riacquistino la loro funzionalità “ri-incontrandosi”.
AD
AD
DB
DB
AD
AD
DB
DB
Sistema del Doppio Ibrido
Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il
promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi.
Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in
grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si
colorano di blu.
Gal4
AD
DB
UAS
Lacz
β-galattosidasi
X-Gal
Sistema del Doppio Ibrido
Creazione di due ibridi
ESCA
PREDA
Proteina A
DBD
Proteina B
AD
Proteina A
DBD
Promotore
Promotore
Gene reporter
Gene reporter
Se le due proteine di interesse interagiscono,
il gene reporter sarà trascritto
Proteina A Proteina B
AD
DBD
Promotore
Gene reporter
APPLICAZIONI DELLE
PROTEINE DI FUSIONE
Saggi di Doppio Ibrido
Saggi di Pull-Down
Proteina di fusione
Proteina Tag
Saggi di legame
Tecniche per studiare le interazioni proteina-proteina
3. Peptide Microarray
• Tecnica “high-throughput” che permette di ottenere risultati su
larga scala in un tempo limitato.
• E’ utilizzata per studiare le interazioni tra il dominio di una
proteina di interesse e il peptide di un’altra proteina.
• Per esempio: il dominio PTP
delle
proteine
fosfatasi
riconosce
brevi
peptidi
fosforilati
esposti
sulle
proteine
substrato
e li
defosforila
FOSFATASI
Dominio PTP
P
Y
Peptide Microarray
• Migliaia di peptidi vengono stampati su un supporto di silice
(microarray) che viene incubato con il dominio proteico di
interesse.
• L’interazione dominio-peptide viene rivelata attraverso l’utilizzo
di un anticorpo coniugato a un fluoroforo
Peptide Microarray
4.
5.
6.
7.
P
GST
P
P
P
SHP2
3.
P
P
P
GST
2.
Stampare su supporto di silice i peptidi di
interesse.
Produrre la proteine di fusione (ex: GSTproteina)
Purificare la proteina di fusione (ex: GSTResina Glutatione)
Controllare su gel di poliacrilammide la
qualità della purificazione
Incubare il microarray di peptidi con la
proteina di fusione
Incubare il microarray con l’anticorpo
coniugato al fluoroforo (ex. Anti-GST)
Misurare l’intensità di fluorescenza che
sarà proporzionale alla quantità di proteina
che ha legato il peptide.
SHP2
1.
Peptide Microarray
Risultato tipico di un esperimento di “peptide microarray”
PEPTIDE
High signal
ALTA INTENSITA’
Low signal
BASSA
INTENSITA’
LEGAME FORTE
LEGAME DEBOLE
intensity
intensity
Validazione “in vivo”
Cellule di mammifera
Drosophila Melanogaster
Topo
Zebrafish