Determinazione dell’affinità
ligando-proteina
• Stechiometria: numero di ligandi per proteina
• Affinità:
stabilità relativa del complesso.
Descritta dalla costante
termodinamica di equilibrio
P+L
PL

PL
Ka 
P L

P  L 
Kd 
PL
L P


Kd


PL
PL
L P 
L





P  PL P  L P K d  P  L P K d  L
CP
Kd

L

K d  L 
C P  L 
PL 
K d  L 
x
y
ax
[PL]
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Kd
0
20
40
60
[L]
80
100
120
[PL]
La concentrazione di proteina deve essere
dell’ordine di grandezza della Kd
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CP=2
CP=10
CP=50
CP=100
0
20
40
60
[L]
80
100
120
[PL]
Grafico semilogaritmico
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
10
100
[L]
Doppi reciproci
[PL]
10
9
8
7
6
5
4
3
C P  L 
PL 
K d  L 
2
1
50
100
150
200
[L]
K d  L  K d 1
1
1




PL CP  L CP L CP
[PL]
Determinazione della stechiometria
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
50
100
[L]
Se ho metà proteina, ma due siti per proteina, apparentemente non cambia nulla
Determinazione della stechiometria
Scatchard plot

P  L 
Kd 
PL
PL  CP  PL
L K d K d
K d  PL  P L  CP  PL L
PL
L 
CP
[PL]
PL
L 
Due siti equivalenti (stessa Kd)
2CP
[PL]
PL
L 
Due siti non equivalenti (diversa Kd)
CP
2CP
[PL]
[L] e CL
Bassa affinità (Kd grande)  assumo [L] ~ CL
Altrimenti:
L  CL  PL
P  CP  PL
C P  L 
C P  C L  PL
PL 

K d  L  K d  C L  PL
PL 
K d  CL  CP 
K d  C L  C P 
2
2
 4  CL  CP
Cooperatività
P + 2L
PL + L
P’ + 2L
P’L + L
PL2
P’L2
Grafico di Hill
P  L
h

PLn 
K
Y

P   PLn  P   P  Lh
h

L

h
K  L 
K

Y
L

1 Y
K
h
Y
log
 h  log L   log K
1 Y