Normative e linee guida per la validazione
dei metodi di analisi
Giampaolo Tommasi
A.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici
Sviluppo Farmaceutico
[email protected]
1
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Introduzione
 Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea
 Finalità studi di validazione
 Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico
 Risultati di una validazione
 Convalida analitica e specifiche di prodotto
 Approfondimenti:
 Stress test - normative
 Finalità studi di degradazione
 Considerazioni generali sulla degradazione
 Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco
 Conclusioni
2
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Perché validare un metodo di analisi
Misurare una caratteristica o proprietà di un prodotto
Titolo principio attivo
Contenuto di impurezze
pH di una soluzione (es. collirio)
Stabilire quanto è attendibile la misura ottenuta
VALIDARE = pesare quanto vale
3
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: FDA
The FDA is responsible for protecting the public health by
assuring the safety, efficacy, and security of human and
veterinary drugs, biological products, medical devices, our
nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation.
The FDA is also responsible for advancing the public health by
helping to speed innovations that make medicines and foods
more effective, safer, and more affordable; and helping the public
get the accurate, science-based information they need to use
medicines and foods to improve their health.
4
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: FDA
 Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods
 Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods
Validation - Chemistry, Manufacturing, and Controls
Documentation
http://www.fda.gov
5
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: Emea
European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the
European Union with headquarters in London. Its main responsibility is the
protection and promotion of public and animal health, through the
evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The
EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products
throughout the European Union. The Agency brings together the scientific
resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national
competent authorities. It cooperates closely with international partners,
reinforcing the EU contribution to global harmonisation.
6
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: Emea

CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >> Guidelines on Validation of
analytical procedures: Definitions and Terminology

CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >> Guidelines on Validation of
analytical procedures: Methodology
http://www.emea.eu.int
7
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: ICH
The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) is a unique project that brings together the
regulatory authorities of Europe, Japan and the United States and experts from the
pharmaceutical industry in the three regions to discuss scientific and technical aspects of
product registration.
The purpose is to make recommendations on ways to achieve greater harmonisation in the
interpretation and application of technical guidelines and requirements for product
registration in order to reduce or obviate the need to duplicate the testing carried out during
the research and development of new medicines.
The objective of such harmonisation is a more economical use of human, animal and
material resources, and the elimination of unnecessary delay in the global development and
availability of new medicines whilst maintaining safeguards on quality, safety and efficacy,
and regulatory obligations to protect public health
8
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Normative sulla validazione: ICH
Q2A >> Text on Validation of Analytical Procedures
Q2B >> Validation of Analytical Procedures: Methodology
http://www.ich.org
9
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Linea guida ICH Q2A
Test di validazione
Identificaz.
Quantitativa
Impurezze
Precisione
-
+
+
-
Accuratezza
-
+
+
-
Specificità
+
+
+
+
Linearità
-
+
+
-
Intervallo
-
+
+
-
Limite di detection (LOD)
-
-
+
+
Limite di quantificazione
-
-
+
-
Robustezza
-
+
+
-
Test di efficienza del sistema
-
+
+
10
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
TEST
PIANO DI STUDIO
REPORT
11
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
PRODOTTO >> Gel a base di Diclofenac sodico
SCOPO DELLO STUDIO >> Trasferimento sito produttivo
DOCUMENTAZIONE >> Dossier farmaceutico
 Attività
Produzione di lotti pilota >> secondo quanto indicato nel dossier
Transfert method >> test statistico
Documenti >> emissione di certificato analitico
12
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
VALUTAZIONE METODO DI ANALISI
Condizioni analitiche
Colonna: LiChrospher RP Select B
M.Ph. >> 50% MeOH - 50% Tampone fosfato
Conc. Diclofenac >> 0.25 mg/ml
Vol. inj. >> 20 µl (5µg diclofenac)
Flow rate >> 1.7 ml/min
pH >> 4.3 circa
l >> 282 nm
tR = 20,447 min
s = 1.51 (s = a/b)
N = 3241
Width = 0,8467 min
Temperatura >> 40°C
13
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
VALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICI
 Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tR = 20,447 min.)
 Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (s = 1,5)
 Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)
CONCLUSIONI
 Picchi con la pancia >> analisi problematica
DECISIONE
 Rivalidazione metodo di analisi
14
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
PIANO DI STUDIO
>> Informazioni
Cosa misuriamo
>> Analisi quantitativa diclofenac
Come misuriamo
>> Tecnica Cromatografica
Principi chimico - fisici >> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer
Campo di applicazione >> Rilascio lotti (SI)
>> Studi di stabilità (SI)
>> Convalida di processo (SI)
>> Cleaning validation (NO)
15
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
PIANO DI STUDIO
>> Informazioni
Chimica sost.esame
>> Impurezze e prodotti di degradazione
Metodi noti
>> Diclofenac in collirio
Forma farmaceutica
>> Eccipienti / Gel
Preparazione campione >> Solubilità sostanza in esame
Tempo analisi
>> Obiettivo max 10 minuti
16
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
CHIMICA DICLOFENAC SODICO
fonte Farmacopea Europea
CHO
COONa
COONa
O
N
NH
Cl
NH
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Br
2-[(2,6-diclorofenil)amino]benzaldeide
OH
1-(2,6-diclorofenil)-1,3-diidro-2H-indol-2-one
O
NH
Cl
2-[(2,6-diclorofenil)aminofenil]acetato di sodio
DICLOFENAC SODICO
NH
Cl
NH
2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenilmetanolo
17
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
FORMULATO PRODOTTO
fonte Dossier farmaceutico
Formulato
Analisi
Diclofenac sodico
>> 1 g
Alto contenuto massa gelificante
Copherol F 1300
>> 1 g
Alto contenuto massa grassa
Carbopol 980
>> 1.50 g
Ammoniaca Sol 10%
>> 2.60 g
Phospholipon 80 >> effetto matrice
Cetiol V
>> 0.50 g
Phospholipon 80
>> 2.00 g
Titriplex III
>> 0.04 g
Eutanol G
>> 0.50 g
Profumo “Vert de Creme” (mix)
Verifiche
Doppia diluizione >> riduzione interf.
Aroma “Vert de Creme” >> 0.02 g
Intervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracarico
Alcool Isopropilico g
>> 20.17g
Analisi placebo Phospholipon 80
Acqua dem.ta
>> q.b. a 100 g
Analisi spettrale
18
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
 Doppia diluizione:
verifiche con vari solventi
 Prove rispetto al Phospholipon
Ipotesi: solvente che aprisse la
matrice gelificante (senza
solubilizzarla)
Obiettivo: Verificare possibile interferenza
con il Phospholipon
Obiettivo: estrarre il P.A. senza
modificare la sua ionizzazione
Campione con Phospholipon
Sperimentale: Solventi di
estrazione >>
Ipotesi: possibile “effetto matrice”
Sperimentale:
>> 102.4%
Campione senza Phospholipon >> 103.7%
MeOH - ACN - Fase Mobile Isopropanolo
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
VALUTAZIONE METODI ANALOGHI
Condizioni analitiche
Colonna: LiChrosorb RP18
M.Ph. >> 60% MeOH - 40%
Tampone fos.to (0.5M) + NaOH 1N
Conc. Diclofenac >> 0.20 mg/ml
Vol. inj. >> 10 µl (2 µg diclofenac)
Flow rate >> 1.0 ml/min
pH = alcalino (magg. 7,0)
l >> 278 nm
Temp. >> 25°C
RIFERIMENTO
tR = 7,141 min
s = 0.86 (s = a/b)
N = 4480
Widh = 0,2511 min
SAMPLE
tR = 8.440 min
s = 1.37 (s = a/b)
N = 1621
Widh = 0,4933 min
20
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI
Condizioni analitiche
Colonna: LiChrospher RP Select B
M.Ph. >> 50% ACN - 50%
Tampone ac.to + N(Et)3 0.01M
Conc. Diclofenac >> 0.08 mg/ml
Vol. inj. >> 5 µl (0,4 µg diclofenac)
Flow rate >> 1.0 ml/min
pH = ( 6,5 circa)
l >> 282/(220) nm
Temp. >> 28°C
SAMPLE in MeOH
21
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - Valutazioni
Dati cromatografici
Metodo originale
Metodo ottimizzato
Tempo ritenzione (tR)
20,447 min.
4,167 min.
Simmetria (s)
s = 1,51
s = 0,89
Efficienza (N)
N = 3241
N = 9618
Base picco
0,8467 min.
0,1 min.
22
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
SPECIFICITA’ SCOPO DEL TEST:
Misurare la sostanza in esame in presenza di sostanze potenzialmente interferenti
TIPOLOGIE TEST
Identificazione  Il metodo analitico deve identificare selettivamente l’analita
Dosaggio  Il metodo analitico deve dosare selettivamente l’analita
Purezza  Il metodo analitico deve interagire selettivamente con l’analita
23
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
Risposta
RANGE E LINEARITA’
100%
100%
Concentrazione
24
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
RANGE E LINEARITA’
Test validazione
Metodo originale
Metodo ottimizzato
Range
4,0 - 6,0 mg
0,2 - 0,6 mg
Coeff. correlazione
0,999
0,999
Pendenza
85537
22944,37
Intercetta
61575
- 5,13
25
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
RANGE E LINEARITA’
Confronto intercette
tabulato 2.14 >> sperim. 1.10
Confronto statistico linearità
3000
Confronto pendenze
tabulato 2.14 >> sperim. 1.08
Confronto intercetta retta
ricostituito con lo zero
tabulato 2.14 >> sperim. 1.13
2000
Area
Confronto intercetta retta
standard con lo zero
tabulato 2.14 >> sperim. 1.15
2500
1500
Standard
1000
Ricostituito
intervallo di validazione
500
0
-500
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
Conc mg/ml
26
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
ACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZA
ACCURATEZZA
Recupero >> -0.71%
PRECISIONE
CV% >> 1.01%
Errore sistematico del metodo di analisi
Errore casuale del metodo di analisi
Test di Efficienza
VALIDARE = pesare quanto vale
 tR >> tra 4.0 e 4.8 min
 s >> tra 0.8 e 1.0
 N >> maggiore 8000
 Rs >> non indicabile
 CV% area >> inf. 2.0%
27
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
CONCLUSIONI
pH fase mobile
Eluizione pH-dipendente
% Modificatore organico
ACN sostituisce MeOH
Temperatura
Da 40°C a 28°C
28
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
 Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico
SPECIFICHE: Prodotto vs. Validazione
ACCURATEZZA
Specifiche prodotto
Recupero >> -0.71%
 Rilascio lotti >> 95% - 105%
PRECISIONE
 Studi stabilità >> 95% - 105%
CV% >> 1.01%
95%
100%
105%
29
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Stress Test >> introduzione
 Aspetti normativi
 Finalità studi di degradazione
 Considerazioni generali sulla degradazione
 Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco
 Temperatura / Umidità
 Luce
 pH
 Agenti ossidanti
 Conclusioni
30
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Aspetti normativi
 Stress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A]
 Stress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R]
 Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B]
 Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A]
 Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]
31
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Aspetti normativi alcune considerazioni ….
 Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1
 Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze
 Non è necessario effettuare studi cinetici
 I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto
 Ampia libertà nella conduzione dei test
32
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Scopo studi di degradazione
 Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.
 Verificare le caratteristiche intrinseche di stabilità di un principio attivo
 Mettere in evidenza quali fattori provocano la degradazione del principio attivo
 Prevedere accorgimenti necessari nello sviluppo formulativo di un prodotto
 Valutare le misure necessarie da adottare al fine di proteggere il prodotto
 Sviluppo e convalida della più adatta procedura analitica
 Anticipare il comportamento del prodotto finito durante gli studi di stabilità
33
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Cosa occorre?
 Personale qualificato
 Conoscenza della chimica organica di degradazione
 Conoscenze analitiche della sostanza in esame
 Interpretazione dei risultati
 Piano sperimentale corretto:
 Caratteristiche strutturali della molecola in studio
 Durata del piano deve avere carattere predittivo
 Tipologia dei test per favorirne la degradazione
34
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Degradazione: considerazione generali
MOLECOLA
TEST
DURATA
35
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Degradazione: la molecola
 Caratteristiche strutturali
Gruppi funzionali vs principali reazioni di degradazione
Ampio ventaglio di principi attivi
 Forma farmaceutica
Eccipienti
Impurezze presenti in materie prime
36
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Degradazione: durata dei test
 Aspetti generali
Carattere predittivo
Raggiungere il 10 - 20% di degradazione
 Esempio: reazione consecutiva di 1° ordine
P.A.
k1
B
k2
C
37
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Degradazione: durata dei test
Modello cinetico per reazioni di degradazione consecutive 1°ordine
120
C
100
80
P.A.
60
40
20
B
0
Tempo
38
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Degradazione: caratteristiche test
 Aspetti generali
Verificare vari fattori ambientali
Replicare i processi degradativi
 Tipologia dei test
Stato Solido:
Stato Liquido:
Esposizione Temperatura-Umidità
Esposizione Luce
Esposizione Luce
Esposizione pH
Esposizione agenti ossidanti
39
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Temperatura - Umidità
 Aspetti normativi
It should include the effect of temperatures (… 50°C - 60°C)…
and humidity (75%RH or greater) where appropriate …
 Campioni analitici
Principi attivi - Miscele (p.a. + eccipienti) - Formulati
Direttamente esposti [rif. Q1A_R2]
 Principali processi degradativi
Idrolisi - Decarbossilazione - Ossidazione - Pirolisi (?!?)
Polimorfismo
40
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Temperatura - Umidità
 Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica
Ea  22 kcal  mol-1
Eq. Arrhenius
T = 60°C
k = A e-Ea/RT
P.A.
k1
B
k2
C
T = 25°C
k(60°C)/k(25°C)  30
60 gg; (T= 60°C)  4,9 aa; (T=25°C)
41
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Temperatura - Umidità
 Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solida
Formazione interfaccia solido-liquido (soluzioni sovrasature)
Principio attivo o eccipienti a basso punto di fusione
Eccesso di solventi residui da processi di granulazione
Assorbimento di umidità (sostanze igroscopiche)
Acqua di idratazione
42
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Protocollo di studio
 Esposizione Temperatura - Umidità
Condizioni:
temperatura >>
umidità>>
50° - 60°C
75% - 85% RH
Durata:
60 giorni
Controlli:
0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni
43
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Luce
 Aspetti normativi
Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of photolysis on
the active substance.
Rif. linea guida Q1B: condizioni sperimentali
 Durata ??
Scopo del test >> forzare la degradazione
Tempo almeno doppio delle condizioni del test di conferma
44
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Luce
Fosforescenza/Fluorescenza
 Fotodegradazione
Emissione calore
h
P.A.
Dimerizzazione
P.A.*
Prodotti di degradazione
fotolitici
fotossidazione
 Esempio >> dimerizzazione
O
O
H
CH3
N
2
O
N
H
h
H
O
CH3 CH3
O
N
N
N
N
H
H
H
O
45
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> Luce
 Esempio >> prodotti di degradazione - fotolisi
H2N
H2N
N
N
N
N
CH3
N
COOH
H
NH2
N
Metoxarato
O
N
N
h
h
N
N
H2N
N
N
CHO
NH2
N
N
COOH
NH2
H2N
COOH
H
COOH
N
O
COOH
 Esempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione
Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)
46
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Protocollo di studio
 Esposizione luce
Condizioni - Stato solido
Secondo ICH Q1B (forced degradation)
Stato liquido
Durata:
3 - 10 giorni
3 giorni
Controlli:
0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni
0 - 1 - 3 giorni
47
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> pH
 Aspetti normativi
…should also evaluate the suscettibility of active substance to
hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or
suspension …
 Campioni analitici
Classico schema a tre punti di pH
 Principali processi degradativi
Idrolisi - degradazioni pH catalizzate
48
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> pH
 Esempio
Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con
uno schema a tre punti di pH
49
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> pH
 Esempio: Hydrochlorothiazide
Cl
H2NO2S
NH
SO2
NH
Andamento degradativo che
richiede uno schema di studio a
più di tre valori di pH
50
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test >> pH
 Esempio: Chlorothiazide
Cl
H2NO2S
N
SO2
NH
Interessante caso di processo di
degradazione multiplo strettamente
legato ai valori del pH
51
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Protocollo di studio
 Esposizione pH
Condizioni
Ambiente Acido >>
Soluzione HCl 0,1 M
Ambiente Neutro >>
Sol.Tampone pH ~ 7
Ambiente Alcalino >>
Soluzione NaOH 0,1M
Temperatura >>
50°- 60°C
Conc. P.A. >>
0,1 – 1,0%
Durata:
7 - 14 giorni
Controlli:
0 - 1 - 3 - (7 - 10 - 14) giorni
Note
ulteriori test in range più definito
52
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Aspetti normativi
Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of oxidation ... on
the active substance.
 Considerazioni generali
Ossigeno molecolare O2 >> stato fondamentale tripletto
Reazioni di ossidazione >> procedono via radicalica
RH + O2
ROO
53
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
Meccanismo di reazione “Autossidazioni”
RH + In
R
+ InH
R• + O2
ROO
ROO + RH
ROOH + R
Propagazione (Kp)
2 ROO
Prodotti inerti
Terminazione (Kt)
Iniziazione (Ri)
d[O 2 ]
Ri
d[ROOH]
d[RH]
  = k p [RH]
dt
dt
dt
2k t
54
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Uso di iniziatori radicalici
CH3
2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile)
[AIBN]
H3C
CH3
N
CN
N
CH3
CN
55
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
CH3
CH3
CH3
N N
H3C
CH3

+
N2
CN
CN
CN
.
H3C
2
Propagazioni
CH3
. +
H3C
Terminazioni
O2
CH3
R. + R .
R R
CN
R. + R O.
R O R
O O.
H3C
CN
CH3
CH3
CH3
O O . + RH
H3C
H3C
CH3
O O H
CN
H3C
CH3
O . + . OH
H3C
CH3
H3C
CN
O. + H C
3
O R
H3C
CN
CN
CN
H3C
O O H+ R.
CH3
O . + R.
CN
CH3
O O H
CN
CH3
CH3
O O.
O H + H3C
H3C
CN
CN
CN
56
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
H3C
Ossidazioni
O
N
 Esempio: Tetrazepam - degradazione
H3C
Cl
N
O
N
Cl
H3C
3'
N
O
N
H3C
OOH
Cl
N
O
N
Idroperossido
Cl
H3C
N
O
O
Cheton-derivato
Cl
Epossido
O
N
NH
O
"Seco"
57
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Esempio: Tetrazepam - cromatografia
58
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Esempio: Tetrazepam - effetto solvente
SOLVENTE
P.A.
Seco
Cheto
Idrop
Epox
Acetonitrile
65,8%
1,9%
11,2%
8,4%
2,8%
Acetonitrile + 20% H2O
68,1%
1,4%
11,4%
9,6%
2,8%
Metanolo
75,2%
2,4%
6,6%
8,3%
1,8%
Etanolo
84,0%
5,2%
1,0%
6,3%
tracce
2-propanolo
89,6%
4,8%
0,3%
4,3%
tracce
59
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Uso di perossido di idrogeno H2O2 >> alcune considerazioni
I risultati devono essere adeguatamente interpretati
Meccanismo di azione ionico
Epossidi e N-ossidi
 Esempio: Tetrazepam & Benzidamina HCl
CH3
H3C
N
Cl
H3C
O
N
H 2 O2
Cl
N
O
N
O
N
O
CH3
N
N
N
CH3
H 2 O2
CH3
O
N
O
N
60
VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ossidazioni
 Uso di ioni di metalli Fe3+ ; Cu2+
Possibili iniziatori
Possono essere presenti in tracce (impurezze di materie prime e
confezionamenti)
Prodotti sensibili all’ossidazione
 Interpretazione dei risultati
azo-derivati più predittivi
H2O2 predittiva per Epossidi e N-ossidi
Attenzione se il prodotto è sensibile a tutti i test
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Protocollo di studio
 Ossidazioni
Condizioni
Reagenti >>
Substrato + AIBN (1:1 mol)
Substrato + tracce ioni metalli (Fe3+ o Cu2+)
Substrato + H2O2 (sol. 3%)
Solvente >>
Temperatura >>
ACN ( + acqua)
40°C (max)
Durata:
48 ore
Controlli:
ogni 24 ore
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Conclusioni (1)
 Lo stress test è predittivo quando mette in evidenza tutte le
impurezze che si possono osservare nella stabilità a lungo
termine ed accelerata.
 Uno stress test predittivo permette di qualificare un metodo
come “stability indicating”.
 Un test è predittivo quantitativamente quando permette di
anticipare una stabilità critica.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Conclusioni (2)
 I saggi di degradazione forzata sono semplici, ma devono
essere interpretati da esperti.
 L’arricchimento delle impurezze nella degradazione forzata
ne facilita l’isolamento e la caratterizzazione.
 Non è necessario identificare tutte le impurezze osservate
nello stress test.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Conclusioni (3)
 La convalida di un metodo analitico comprende i test di
specificità, linearità, accuratezza, precisione, robustezza
 A meno di non avere informazioni esaurienti dal produttore,
va sempre effettuato un test di stress della materia prima.
Inoltre va verificato anche il comportamento del prodotto
finito alle comuni condizioni di stress (compatibilità con
eccipienti).
 Occorre prevedere nel metodo una sezione di calcolo per
le impurezze incognite (ICH Q3B(R)).
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Precisione
 La precisione di un metodo analitico esprime la vicinanza (grado di dispersione) tra una
serie di misurazioni ottenute da vari campionamenti di un medesimo campione omogeneo
secondo le condizioni prescritte.
 La precisione può essere considerata a tre livelli:
ripetibilità, precisione intermedia, e riproducibilità.
 La precisione dovrebbe essere investigata utilizzando un “prodotto finito” omogeneo.
Comunque, se non è possibile ottenere un campione omogeneo, può essere investigata
usando un campione preparato artificialmente o un campione in soluzione.
 La precisione di un metodo analitico è di solito espressa come la varianza, la deviazione
standard o il coefficiente di variazione della serie di misurazioni.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Accuratezza
 L’accuratezza di un metodo analitico esprime la differenza
tra il valore convenzionalmente accettato come vero o
come valore di riferimento e quello trovato
 Può a volte essere definita “esattezza”
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Specificità

La specificità è la capacità di valutare inequivocabilmente l’analita in presenza di componenti di cui può
essere prevista la presenza. Tipicamente questi potrebbero includere impurezze, degradati, matrici, etc.

La mancanza di specificità di una singola procedura analitica può essere compensata da altre procedure di
sostegno.

Questa definizione ha le seguenti implicazioni:
1.
Identificazione: per accertare l’identità di un analita
2.
Prove di purezza: per accertarsi che tutte le procedure analitiche effettuate permettano una dichiarazione
esatta del contenuto delle impurità di un analita, i.e. prova delle sostanze correlate, metalli pesanti,
contenuto dei solventi residui, etc.
3.
Analisi (contenuto o efficacia): per fornire un risultato esatto che permette una dichiarazione esatta sul
contenuto o sull’efficacia dell’analita in un campione.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Linearità
 La linearità di una procedura analitica è la relativa capacità
(all’interno di un certo intervallo) di ottenere dei risultati che
sono direttamente proporzionali alla concentrazione
dell’analita nel campione.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
A   l c
A  a  bc
Legge Lambert-Beer
Risposta
Linearità
Generica
L&B
Generica
a  b  cc
%
a 'b'cr
Se a=a’=0 e b=b’:
100%
100%
Concentrazione
cc
%
cr
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Intervallo (range)
 Il range di un metodo analitico è l’intervallo fra la
concentrazione superiore e quella inferiore di analita nel
campione (queste concentrazioni comprese) per cui è
stato dimostrato che la procedura analitica ha un livello
adatto di precisione, di accuratezza e di linearità.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Limite di detection (LOD)
 Il LOD in un metodo analitico è la minima quantità di
analita in un campione che può essere rilevata ma non
necessariamente essere quantificato come valore
esatto.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Limite di quantificazione (LOQ)
 Il limite di quantificazione di una procedura analitica è la
quantità più bassa di analita che può essere determinato
quantitativamente in un campione con adatta precisione ed
accuratezza.
 Il LOQ è un parametro delle analisi quantitative per i bassi
livelli di composti in matrici di campioni, ed è usato
particolarmente per la determinazione di impurezze e
prodotti di degradazione.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Robustezza
 La robustezza di una procedura analitica è una misura
della relativa capacità di rimanere inalterata nonostante
piccole intenzionali variazioni dei parametri del metodo e
fornisce un’indicazione della relativa affidabilità durante
l’uso normale.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Test di efficienza del sistema
 Il test di efficienza del sistema è parte integrante di molte
procedure analitiche. Il test si basa sul concetto che
l’apparecchiatura, l’elettronica, le operazioni analitiche ed i
campioni da analizzare costituiscono un sistema integrale
che può essere valutato come tale. I parametri da stabilire
nel test di efficienza del sistema dipendono dal tipo di
procedura che si sta convalidando. Per informazioni
supplementari vedasi le relative farmacopee.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ripetibilità
 La ripetibilità esprime la precisione nelle stesse condizioni
di gestione in un breve intervallo di tempo.
 La ripetibilità è anche chiamata precisione di intra-analisi
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Precisione intermedia
 La precisione intermedia esprime le variazioni di intralaboratorio : giorni differenti, analisti differenti, attrezzature
differenti, etc.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Riproducibilità
 La riproducibilità esprime la precisione fra i laboratori ( studi
collaborativi, solitamente applicati alla standardizzazione di
metodologie).
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