VIROLOGIA Sviluppo e Applicazioni degli Agenti Antivirali IL PARADOSSO DELLE CHEMIOTERAPIA ANTIVIRALE: So Much Knowledge, So Few Antivirals • Le molecole dotate di attività antivirale sono spesso tossiche per l’ospite • I farmaci antivirali dovrebbero avere un’efficacia del 100% • Alcuni virus patogeni importanti si coltivano difficilmente o non si coltivano affatto in laboratorio (es. HCV, HBV, HPV) • Per alcuni virus patogeni non è disponibile un modello animale che riproduca la patologia umana (es. morbillo, HCV) • Problema della tempestività della diagnosi e del trattamento delle infezioni acute cellular viral The antiviral repertoire: the approved compounds Virus trattabili con farmaci antivirali Virus dell’herpes simplex (HSV) Virus della varicella-zoster (VZV) Citomegalovirus (CMV) Virus dell’immunodeficienza umana (HIV) Virus dell’influenza Virus respiratorio sinciziale Virus dell’epatite A, B, C (HAV, HBV, HBC) Papillomavirus (HPV*) Picornavirus *Sono disponibili protocolli di sperimentazione Farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA Farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA HERPESVIRUS HSV Aciclovir Penciclovir Adenosina arabinoside Iododesossiuridina HSV e VZV Valaciclovir Famciclovir Aciclovir CMV Ganciclovir Fosfonoformato (foscarnet) Cidofovir Fomivirsen Farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA Virus dell’immunodeficienza umana (HIV) Inibitori della trascrittasi inversa nucleosidici non nucleosidici Inibitori della proteasi Azidotimidina (zidovudina) Didesossiinosina (didanosina) Didesossicitidina (zalcitabina) Stavudina (d4T) Lamivudina (3TC) Nevirapina Delaviridina Saquinavir Ritonavir Indinavir Nelfinavir Farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA Virus dell’influenza Ceppo A Amantadina Rimantadina Ceppi A e B Zanamivir Oseltamivir Farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA Virus dell’epatite C (HCV) Interferone-aRibavirna Papillomavirus (HPV) Interferone-a Virus respiratorio sinciziale, Virus Lassa Ribavirina Picornavirus Pleconaril Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Blind screening strategia superata Strategie innovative • Mechanism-based screens • Cell-based assays • Combinatorial chemistry • High-throughput screens • Rational drug designs • Bioinformatics Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali R&D of antiviral discovery L’intero processo può durare 10 anni e costare dai 100M$ ai 500M$ Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Blind screening strategia superata Strategie innovative • Mechanism-based screens • Cell-based assays •Combinatorial chemistry • High-throughput screens • Rational drug designs • Bioinformatics Mechanism-based assay for proteases Mechanism-based assay for proteases Mechanism-based assay for viral nuclease Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Blind screening strategia superata Strategie innovative • Mechanism-based screens • Cell-based assays •Combinatorial chemistry • High-throughput screens • Rational drug designs • Bioinformatics Cell-based assay for HIV protease Grafsrom et al., Adv. Exp. Med. Biol. 312:25-40, 1992 Cell-based assay for transcription regulators Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Blind screening strategia superata Strategie innovative • Mechanism-based screens • Cell-based assays •Combinatorial chemistry • High-throughput screens • Rational drug designs • Bioinformatics High-throughput screens Combinatorial chemistry Es. Se si combinano 10 linkers con 10000 piccole molecole si ottengono 109 nuove combinazioni Ricerca e sviluppo di farmaci antivirali Blind screening strategia superata Strategie innovative • Mechanism-based screens • Cell-based assays •Combinatorial chemistry • High-throughput screens • Rational drug designs • Bioinformatics Stucture-based drug design A B Struttura della proteasi di HIV legata agli inibitori saquinavir (A) e indinavir (B) Vondrasek J. et al., Nat. Struct. Biol. 4:8, 1997 Some viral targets for antiviral drug discovery Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Adsorbimento Trascrizione Agente Virus Antagonisti dei recettori - recettori solubili - peptidomimetici HIV (es. gp120/CD4) Anticorpi neutralizzanti Molti virus Destran solfato, eparina HSV Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Penetrazione e scapsidazione Agente Virus Sintesi proteica Amantadina, rimantadina Virus dell’influenza A Replicazione del DNA (polimerasi virale) Tromantadina HSV Arildone, disossarile, pleconaril Picornavirus Trascrizione Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Trascrizione Trascrizione Agente Sintesi proteica Interferone Replicazione del DNA (polimerasi virale) Oligonucleotidi antisenso Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Virus HAV, HBV, HCV, HPV CMV Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Trascrizione Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Sintesi proteica Agente Interferone Virus HAV, HBV, HCV, HPV Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Trascrizione Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Replicazione del DNA (polimerasi virale) Agente Virus Analoghi nucleosidici Herpesvirus, HIV, HBV Inibitori non nucleosidici Herpesvirus, HIV Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Biosintesi dei nucleosidi Penetrazione e Scapsidazione Agente Virus Ribavirina Virus respiratorio sinciziale Virus della febbre di Lassa Trascrizione Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Trascrizione Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Agente Virus Analoghi nucleosidici HSV, VZV Esempi di bersagli di farmaci antivirali Adsorbimento Penetrazione e Scapsidazione Trascrizione Sintesi proteica Replicazione del DNA (polimerasi virale) Biosintesi dei nucleosidi Recupero dei nucleotidi (timidina chinasi) Maturazione (proteasi) Maturazione (proteasi) Agente Virus Analoghi di substrato Peptidomimetici HIV The prototypic compounds (pharmacophores) of important classes of antiviral agents used today Many well-known antiviral compounds are nucleoside and nucleotide analogs Analoghi nucleosidici • Costituiscono la maggior parte dei farmaci antivirali • Hanno come bersaglio le DNA polimerasi virali e le trascrittasi inverse • Hanno una modificazione della base, dello zucchero o di entrambi • Devono essere fosforilati nella forma trifosfata da chinasi virali e/o cellulari • Le polimerasi virali sono inibite selettivamente perché perché legano il nucleotide modificato con maggiore affinità (100 volte) rispetto agli enzimi cellulari Analoghi nucleosidici: meccanismo di azione Assenza di un 3’-idrossile sullo zucchero Impediscono l’allungamento della catena Modificazione della base Alterano il riconoscimento e l’appaiamento delle basi Farmaci anti-erpetici: Aciclovir E’ un analogo della guanosina ha una catena laterale aciclica (idrossietossimetil) al posto del desossiribosio E’ attivo selettivamente contro HSV e VZV (meno) Viene utilizzato negli episodi acuti e per prevenire le recidive Non elimina l’infezione latente La resistenza si sviluppa in seguito a mutazioni della timidina chinasi o della DNA polimerasi virale Aciclovir: meccanismo di attivazione Farmaci anti-erpetici: Famciclovir, Valaciclovir Sono dei proprofarmaci: necessitano 2 eventi di attivazione • eliminazione della catena laterale • fosforilazione Hanno una maggiore biodisponibilità Sono attivi contro HSV e VZV Farmaci anti-erpetici: Ganciclovir E’ un analogo della guanosina ha una catena laterale aciclica (diidrossipropossimetil) al posto del desossiribosio E’ attivo selettivamente contro CMV Viene utilizzato negli episodi acuti e come chemioprofilassi Ha un intervallo terapeutico molto ristretto: mielotossicità La resistenza si sviluppa in seguito a mutazioni della chinasi o della DNA polimerasi virale Chain termination by antiviral nucleoside analogs Farmaci anti-erpetici: Foscarnet E’ un analogo del pirofosfato (acido fosfonoformico) Inibisce la replicazione virale legandosi alla DNA pol nel sito di scambio del pirofosfato E’ attivo contro CMV, HSV, VZV, (HIV) E’ il farmaco di scelta per il trattamento di ceppi di CMV resistenti al ganciclovir E’ nefrotossico La resistenza si sviluppa in seguito a mutazioni della DNA polimerasi virale Farmaci anti-erpetici: Fomivirsen E’ un oligonucleotide antisenso fosforotioato complementare all’mRNA del gene IE2 di CMV 21 nt GCG TTT GCT CTT CTT CTT GCG Inibisce la replicazione virale impedendo la traduzione del messaggero IE2 mRNA ribosoma fomivirsen E’ utilizzato per il trattamento intravitreale della retinite da CMV in pazienti con AIDS resistenti o non tolleranti ad altri trattamenti E’ il primo oligo antisenso approvato dalla FDA nel 1998 Farmaci anti-erpetici: Fomivirsen Farmaci anti-erpetici: Fomivirsen Farmaci anti-erpetici: Fomivirsen Inhibition of HCMV IE proteins EC50= 0.1 mM Antiviral activity Farmaci anti-erpetici: Fomivirsen Oligo antisenso in trials clinici DA: Kurrek J. Antisense technologies. Eur. J. Biochem. 270, 1628-44 (2003) Farmaci anti-influenzali: Amantadina e Rimantadina Sono amine tricicliche Amantadina cloridrato Rimantadina cloridrato Inibiscono la liberazione dell’RNA virale dopo la decapsidazione bloccando la proteina M2 della matrice virale Sono utilizzate nella terapia e nella chemioprofilassi dell’influenza da virus di tipo A Devono essere somministrate entro 24-48 ore dalla comparsa dei sintomi L’insorgenza di resistenze è frequente per mutazioni a carico della proteina M2 o della emoagglutinina Struttura dell’ortomixovirus pompa protonica ribonucleoproteine proteina della matrice neuraminidasi emoagglutinina Amantadina e Rimantadina: meccanismo di azione Ingresso e decapsidazione del virus influenzale A: ruolo della proteina di matrice M2 HA Acidificazione dell’endosoma Esposizione dei domini fusogeni M2 Pompa protonica virale Pompa protonica cellulare Disassociazione M1 e RNA genomico Amantadina e Rimantadina: meccanismo di azione Interazione dell’amantadina con il dominio transmembrana della proteina M2 del virus influenzale di tipo A Farmaci anti-influenzali: gli inibitori della neuroaminidasi, un esempio di structure-based design di inibitori della replicazione virale La Neuraminidasi: struttura e funzione E’ una glicoproteina transmembrana tetramerica Taglia il legame a-chetosidico tra un ac. neuraminico terminale e la catena oligosaccaridica Distrugge i recettori riconosciuti dall’HA Facilita la penetrazione del virus inglobato nelle mucine ricche di ac. neuraminico In azzurro e in giallo sono rappresentati gli aminoacidi invarianti presenti nel sito attivo. In rosso l’acido neuraminico Facilita il rilascio della nuova progenie virale tagliando i residui di ac. neuraminico presenti sia sulla superficie cellulare sia sulle glicoproteine virali La Neuraminidasi: funzione P. Palese, M. Ueda, K. Tobita, R.W. Compans. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology 61:397–410 (1974). 33°C WT phenotype Virioni liberi infettivi 39.5°C NA- phenotype Virioni aggregati non infettivi Sviluppo di inibitori della NA 1 2 Cristallizzazione Strutturistica Struttura della NA del virus dell’influenza A Sviluppo di inibitori della NA 3 Struttura cristallografica della NA con un inibitore (Zanamivir) legato al sito attivo Rational drug design Sviluppo di inibitori della NA Relenza (Biota/Glaxo) FDA approved Inhalation Tamiflu (Gilead/Hoffmann La Roche) FDA approved Oral (BioCryst/ Johnson & J) Clinical trials Oral Sviluppo di inibitori della NA: attività in vitro Cellule non trattate. Il virus viene assemblato e rilasciato normalmente Cellule trattate con un inibitore NA. Il virus è presente in grossi aggregati non infettivi Farmaci antiinfluenzali: Zanamivir e Oseltamivir Sono analoghi dell’acido neuraminico (sialico) L’azione antivirale si esplica inibendo selettivamente la NA dei virus influenzali di tipo A e B Sono impiegati nella terapia e nella profilassi dell’influenza. Riducono la durata della malattia se assunti entro le prime 48 ore. Zanamivir: per inalatoria Oseltamivir: per via orale La resistenza si sviluppa in seguito a mutazioni della NA virale I farmaci antiretrovirali Il ciclo replicativo di HIV Adsorbimento Fusione Penetrazione Adsorbimento, Legame ai recettori, Fusione Il recettore virale è costituito da un trimero dell’eterodimero gp41/gp120 Le due proteine derivano da un precursore comune la gp160 che viene tagliata da proteasi cellulari gp41 gp120 CD4 I Adsorbimento II Legame al CD4 III Legame al corecettore IV Fusione Recettori della gp120 CD4 gp41 è il recettore ad alta affinità gp120 CD4 sCD4-IgG Cyanovirin-N Linfociti T helper, macrofagi, cellule dendritiche Galattosilceramide e glicolipidi correlati Recettori virali alternativi in epitelio della mucosa rettale e vaginale, spermatociti, astrociti, oligodendrociti Inibitori del legame gp120-CD4 (in clinical trials) gp41 gp120 CD4 sCD4-IgG È una proteina di fusione tetravalente disegnata per legare e neutralizzare HIV prima del legame con il CD4 Cyanovirin-N CD4 D1-D2 Hu k-light chain FC Hu IgG2 heavy chain FC E’ una proteina di 101 aa isolata originariamente da un estratto acquoso del cianobatterio Nostoc ellipsosporum. Ora è prodotta in E.coli. Ha un potenziale per un uso topico per la prevenzione della trasmissione sessuale di HIV Legame al corecettore gp41 CD4 gp120 Corecettore CCR5 CXCR4 SCH-C AMD3100 SCH-D TAK779 PRO140 • I corecettori di HIV sono dei recettori cellulari per le chemochine • Appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati alle G proteins con sette domini trans-membrana • L’interazione CD4-gp120 fa esporre i siti di legame della gp120 per il corecettore CXCR4 E’ il corecettore per i ceppi T-tropici (X4) di HIV CCR5 E’ il corecettore per i ceppi macrofago-tropici (R5) di HIV The co-receptor story • Nei primi anni ‘90 fu chiaro che alcuni individui erano resistenti all’infezione nonostante ripetute esposizioni e che alcuni sieropositivi sopravvivevano a lungo long term survivors (Cao et al., New England J. Of Medicine, 332:201-208, 1995) • Nel 1996 vennero identificati i corecettori di HIV: CCR5 e CXCR4 (Alkhatib et al., Science 272:1952-1955, 1996; Feng et al., Science 272:872-877, 1996) • Poco dopo emerse l’idea che gli individui resistenti avessero dei corecettori mutati (Liu et al., Cell 86:367-377, 1996; Samson et al., Nature 272:722-725, 1998) The co-receptor story • Per verificare questa ipotesi Samson e coll. sequenziarono il gene per CCR5 di tre individui resistenti e in uno di questi trovarono una delezione chiamata D32 • HIV non entra in cellule che hanno un corecettore CCR5 D32 implicazioni per lo sviluppo di inibitori • Uno screening su un ampio numero di individui Europei, Giapponesi e Africani ha rivelato che l’allele CCR5 D32 è presente nel 9% dei caucasici ma è completamente assente negli altri gruppi • Due ipotesi: deriva genetica selezione naturale (durante l’epidemia di peste del 14° secolo in Europa si sarabbe selezionato l’allele CCR5 D32 perché conferirebbe resistenza a tale infezione) Inibitori del legame al corecettore gp41 CD4 Sono stati sviluppati numerosi inibitori dei corecettori che si sono dimostrati efficaci in studi preclinici gp120 PROBLEMI: Corecettore CCR5 SCH-C SCH-D TAK779 PRO140 CXCR4 AMD3100 • Inibitori di CCR5 possono guidare l’evoluzione di ceppi R5 verso i più virulenti ceppi X4 che utilizzano CXCR4 come corecettore • Inibitori CXCR4 potrebbero avere effetti indesiderati sul sistema immunitario topi ko per CXCR4 mostrano mortalità perinatale, con difetti linfopoietici, mielopoietici e di sviluppo nervoso e cardiaco Fusione: struttura della gp 41 HR1 Peptide fusogeno HR2 NH2 Dominio esterno Envelope virale COOH Dominio interno Fusione: ruolo della gp41 FORMA NATIVA FORMA INTERMEDIA Membrana cellulare Dominio gp120 gp41 fusogeno HR1 CD4 corecettore Membrana virale HR2 FUSIONE TRIMER OF HAIRPINS POSTFUSIONE Inibitori della fusione (in clinical trials) FORMA INTERMEDIA Dominio Interagiscono con la forma intermedia di gp41 Enfuvirtide (T20) e T1249 T20 è un peptide sintetico omologo a 36 aminoacidi conservati nella regione HR2 di gp41. Impedisce la formazione del complesso HR1/HR2 prevenendo la fusione delle membrane. T1249 è simile a T20, più potente e attivo sui ceppi di HIV resistenti a T20 Questi farmaci non dovrebbero sviluppare resistenze crociate con gli altri farmaci disponibili 5-Helix IQN17 fusogeno HR1 HR2 Il ciclo replicativo di HIV Trascrizione inversa Struttura della trascrittasi inversa di HIV E’ una proteina eterodimerica costituita dalle subunità p51 e p66 Inibitori della trascrittasi inversa di HIV Analoghi nucleosidici: Zidovudina (AZT) Didanosina (ddI) Zalcitabina (ddC) Stavudina (d4T) Lamivudina (3TC) Sono degli inibitori competitivi e agiscono come terminatori di catena nella sintesi del DNA provirale La selettività di azione deriva dall’affinità molto maggiore (100 volte) per la RT rispetto alle DNA Polimerasi umane. Inibitori della trascrittasi inversa di HIV Analoghi nucleosidici: Zidovudina Didanosina Zalcitabina Stavudina Lamivudina SPETTRO DI AZIONE: HIV-1 HIV-2, HTLV-1 Inibiscono la replicazione virale nei linfociti del sangue periferico e nei macrofagi del sistema nervoso centrale, ma sono meno attivi sui monociti-macrofagi e su cellule quiescenti. RESISTENZE: Frequenti e a volte crociate per mutazione della RT Inibitori della trascrittasi inversa di HIV Inibitori non nucleosidici: Delavirdina Nevirapina Loviride Efavirenz Sono inibitori non competitivi della RT e non vengono incorporati nella catena nascente del DNA provirale Inibitori della trascrittasi inversa di HIV Inibitori non nucleosidici: Si legano ad una tasca idrofobica vicino al sito attivo della RT bloccando la sintesi del DNA provirale Movimenti strutturali della RT indotti dal legame di inibitori non nucleosidici In giallo e in verde: scheletro e aminoacidi della RT non legata In blu e in rosso: scheletro e aminoacidi della RT legata ad un inibitore Il sito di legame esiste solo in presenza dell’inibitore Sito di legame agli inibitori Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa di HIV Il meccanismo di azione non è chiaro ma si pensa che alterino la struttura dell’enzima a livello del sito catalitico, del sito di legame all’acido nucleico di stampo e del sito di legame ai dNTP Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa di HIV Delavirdina Nevirapina Loviride Efavirenz SPETTRO: sono dotati di selettività di azione per HIV-1 ma sono privi di attività per HIV-2 ed altri retrovirus. Sono sempre utilizzati in terapia di combinazione. RESISTENZA: Le resistenze sono frequenti e crociate per mutazioni puntiformi della RT. Non sono state segnalate resistenze crociate con gli analoghi nucleosidici e con gli inibitori delle proteasi Il ciclo replicativo di HIV Maturazione La Proteasi di HIV E’ codificata dal gene pol (99 aa) E’ un enzima dimerico Appartiene alla famiglia delle aspartil-proteasi L’aspartato 25 è fondamentale per la catalisi E’ essenziale per la produzione di virioni maturi (come la rennina e la pepsina) Attività della proteasi di HIV La proteasi di HIV taglia tra una fenilalanina, o una tirosina e una prolina Nessuna proteasi umana ha questa specificità: possibile sviluppo di inibitori! Ruolo della proteasi di HIV Poliproteina gag-pol (9 siti di taglio) MA CA p2 NC p1 p6 MA CA p2 NC p1 p6 MA MA CA CA p2 p2 NC NC p1 p1 Protease Protease Protease p6 p6 Protease RT integrasi RT integrasi RT RT integrasi integrasi Ruolo della proteasi di HIV Sviluppo di inibitori della proteasi di HIV Sviluppo di inibitori della proteasi di HIV A B Struttura della proteasi di HIV legata agli inibitori saquinavir (A) e indinavir (B) Vondrasek J. et al., Nat. Struct. Biol. 4:8, 1997 Inibitori della proteasi di HIV Saquinavir Indinavir Ritonavir VX-478 Nelfinavir Inibitori della proteasi di HIV Sono dei peptidomimetici Agiscono come inibitori competitivi SPETTRO: HIV-1 e HIV-2 RESISTENZE: frequenti in monoterapia e a volte crociate Monitoraggio dell’efficacia farmacologica Si utilizzano due indicatori di malattia: Il n° dei linfociti T CD4+ >500/ml è un valore normale <200/ml è la definizione di AIDS Si misura con la citofluorimetria Il n° di copie di HIV RNA 50 copie/ml di plasma è il limite di detectabilità Si misura con la PCR Monitoraggio dell’efficacia farmacologica In una terapia efficace… Il n° dei linfociti T CD4+ AUMENTA Immunoricostituzione Il n° di copie di HIV RNA DIMINUISCE Blocco della replicazione virale Il problema delle resistenze farmacologiche REPLICAZIONE=MUTAZIONE 1010 vironi vengono prodotti giornalmente… Assumendo un tasso di mutazione di circa 10-4 … In assenza di attività proofreading della RT… Si genera una mutazione in ogni nuovo genoma virale (9200 nucleotidi) Evoluzione di HIV in un singolo paziente BLU ROSSO GIALLO VERDE NERO 33 varianti in un singolo paziente! linfonodi sangue periferico milza polmoni gangli dorsali Ait-Khaled et al., AIDS 9:657-683, 1995 Il problema delle resistenze farmacologiche REPLICAZIONE=MUTAZIONE LE MUTAZIONI EMERGONO SPONTANEAMENTE IN ASSENZA DI SELEZIONE Variabilità genetica dei virus a RNA (HIV-1, HCV) e tasso ottimale di mutazione Il problema delle resistenze farmacologiche REPLICAZIONE=MUTAZIONE Se la dose di farmaco somministrata non sopprime completamente lreplicazione virale verranno selezionati virus mutanti HAART: highly active antiretroviral therapy Prevede l’impiego in associazione di inibitori della RT e della proteasi Permette di ottenere una maggiore potenza antiretrovirale Riduce l’insorgenza di ceppi resistenti. Es. se la resistenza ad un farmaco avviene 1 volta ogni 103 virioni e quella ad un altro farmaco avviene ogni 104 virioni la probabilità che si generi un genoma con le due mutazioni è data dal prodotto delle due probabilita: 1 su 107 virioni Reyatax = Atazanavir (PI) Norvir = Ritonavir (PI) Truvada = Emtricitabine+Tenofovir (NRTI)
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