MYCOBACTERIA
Mycobacteria
• Bacilli (2-4 µm), forme filamentose
(molto sottili fino a 10-15 µm)
• Immobili
• Asporigeni
• Sprovvisti di capsula
• Aerobi obbligati
• Alcool-acido resistenti
Classificazione
Struttura cellulare
• Parete cellulare molto spessa
• Componenti della parete:
peptidoglicano, diaminopimelato,
polisaccaridi (glucano, mannano,
arabino-galattano, arabino-mannano)
• Inclusi citoplasmatici (lipidi,
glicogeno, polimetafosfati)
Parete cellulare
• Composizione:
– Grosse quantità di
glicolipidi:
• acido micolico (60%)
• complessi lipidiarabinogalattani
• lipoarabinomannani
– Scarso petidoglicano
Gran parte delle proprietà esclusive che
caratterizzano il genere Mycobacterium
sono, direttamente o indirettamente,
legate alla struttura della parete
cellulare
Mycobacterium spp.
Parete cellulare
• Funzioni:
– Forma e prevenzione lisi
osmotica (peptidoglicano)
– Inibizione ingresso composti
chimici
• Crescita lenta
• Maggiore resistenza agli
agenti chimici
• Maggiore resistenza alla
fagocitosi
– Induzione sintesi citochine
(TNF-) da parte dell’acido
micolico
I LIPIDI DELLA PARETE
BATTERICA
- GRASSI
SOLUBILI IN
ACETONE
- CERE
- FOSFATIDI
CERE
• Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i
quali gli acidi micolici) ed alcoli.
La cera D, che in realtà è un
glicopeptidolipide, è soprattutto nota per
le sue proprietà adiuvanti; essa infatti,
se inoculata in emulsione idro-oleosa
associata ad un antigene proteico,
potenzia enormemente la risposta immune
umorale e cellulare del soggetto ricevente
verso l’antigene suddetto.
ACIDI MICOLICI
• Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più
di frequente si trovano esterificati nelle
molecole lipidiche, si tratta di acidi
grassi β-idrossilati caratterizzati da una
lunga catena satura di atomi di C (da 83
a 93)
A livello della superficie esterna del cell
wall gli acidi micolici svolgono la funzione
di recettori fagici.
FATTORE CORDALE
Un micoside oggetto
di studi approfonditi
è il DIMICOLILTREALOSO meglio
noto col nome di
FATTORE CORDALE,
così chiamato perché
i micobatteri
tubercolari, privati di
tale sostanza,
perdono la
caratteristica di
svilupparsi, su certi
terreni di coltura, in
fasci serpentiformi.
FOSFATIDI
• Consistono di glicerolo esterificato con
acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido
fosforico
Sono capaci di evocare da soli una reazione
cellulare granulomatosa caratteristica e
sovrapponibile a quella che si osserva
nell’infezione tubercolare
CARATTERISTICHE ANTIGENICHE
ANTIGENI
Natura
Polisaccaridica
(parete cellulare)
Arabinogalattani
Immunogeni solo se
inoculati insieme alle
cellule
Natura proteica
(citoplasmatici)
Responsabili della
sensibilizzazione
di tipo allergico
Mycobacterium tuberculosis
MECCANISMI DELL’AZIONE
PATOGENA
La tubercolosi è un’affezione polmonare e
pertanto diffonde per via aerea da uomo a
uomo attraverso i nuclei essiccati delle
goccioline di saliva emessi con la tosse dei
malati di tubercolosi
La
prima
infezione
si
traduce
in
un’infiammazione localizzata a carattere
essudativo di un limitato distretto del
parenchima polmonare con compromissione
dei linfonodi mediastinici (COMPLESSO
PRIMARIO)
Mycobacterium tuberculosis
in lung
MECCANISMI DELL’AZIONE
PATOGENA
 Al complesso primario segue uno STATO
ALLERGICO evidenziabile mediante
iniezione di TUBERCOLINA che
generalmente dura tutta la vita
 In seguito ad una reinfezione o
riattivazione del complesso primario,
l’infezione può compromettere il
parenchima polmonare e diffondere a
qualsiasi organo
DIAGNOSI DI LABORATORIO
• ESAME MICROSCOPICO
• ESAME COLTURALE
• IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
• TIPIZZAZIONE FAGICA
• ANTIBIOGRAMMA
ESAME MICROSCOPICO
FLUORESCENZA
COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen
FLUORESCENZA
400x
ESAME MICROSCOPICO
COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen
L’esame microscopio assume, per la ricerca dei
micobatteri, una rilevanza diagnostica
che non trova riscontro in altri settori della
batteriologia, e ciò grazie alla peculiare
proprietà di tali microorganismi di essere alcoolacido resistenti.
La natura della alcool-acido
resistenza non è ancora del tutto chiarita, essa
sembra comunque correlata alla
componente lipidica della parete cellulare: gli
acidi micolici si complesserebbero infatti
con la fucsina impedendone il rilascio nonostante
il trattamento con alcool ed acido
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (1 di 2)
Step 1:
• Versare la fucsina basica
Step 2:
• Fare evaporare scaldando il colorante
alla fiamma per 5 min
• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Tecnica (2 di 2)
Step 3:
• Decolorare con alcool-acido fino alla
scomparsa del colorante (circa 2 min)
• Lavare con acqua
Step 4:
• Contrastare con blu di metilene per
1-2 min
• Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Osservazione microscopica
• Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono
colorati in rosso
• Gli organismi non acido-resistenti risulteranno
colorati in blu
Ziehl-Neelsen
1000x
ESAME COLTURALE
• L’esame colturale per micobatteri presenta delle peculiarità,
estranee alla batteriologia comune, legate alla lentezza con
cui tali germi crescono sui terreni di coltura.
• Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra i micobatteri
e l’eventuale flora associata è infatti tale che la presenza
di quest’ultima, sia pur costituita da specie non
particolarmente invasive ed a carica microbica ridotta,
finisce regolarmente con lo sfruttare completamente tutta
la superficie di terreno a disposizione ben prima che le
colonie dei micobatteri, ivi comprese anche le specie a
crescita più rapida, possano raggiungere dimensioni tali da
poter essere apprezzate.
• La coltivazione dei micobatteri è possibile solo a condizione
che questi si trovino in coltura pura (eventualità limitata in
pratica solo a materiali particolari quali liquor, liquidi
cavitari, sangue) o che a tale condizione possano essere
ricondotti artificialmente (decontaminazione).
LA DECONTAMINAZIONE
Il decontaminante ideale è una sostanza dotata di attività
antibatterica su tutta la flora associata e del tutto priva di
attività nei confronti dei micobatteri.
a) NaOH al 4%. Può essere considerato il capostipite dei
procedimenti di decontaminazione (svolge anche azione
fluidificante); ormai non più usato a causa dell’elevata
lesività sui micobatteri.
b) H2SO4 al 4%. E’ eccessivamente lesivo per i micobatteri.
c) Acido ossalico al 5%. Il suo impiego è giustificato solo
per materiali fortemente contaminati da Pseudomonas
aeruginosa essendo assai lesivo per i micobatteri.
d) Fosfato trisodico al 25% + cloruro di benzalconio allo
0,3%. Decontamina e fluidifica al tempo stesso, la lesività
sui micobatteri è ridotta e le contaminazioni risultano
contenute.
f) Fosfato trisodico allo 0,03% + NaOH allo 0,05% + di
isobutil-naftalina-sulfonato allo 0,03%. L’attività
decontaminante è molto buona, media la lesività sui
micobatteri.
CARATTERISTICHE
COLTURALI
• velocità di crescita
• aspetto delle colonie
–
–
–
–
rugose lisce
fotocromogene
scotocromogene
non pigmentate
• crescita a varie temperature
• test di inibizione selettiva
TERRENI SELETTIVI
Terreni
Componenti
Sostanze inibitrici
Lowenstein-Jensen
Uova coagulate, Sali,
glicerolo, fecola di
patate
Verde malachite,
cicloesimide,
lincomicina, acido
nalidixico
Middlebrook 7H10
Sali, vitamine,
cofattori, acido
oleico, albumina,
catalasi, glicerolo
Terreno 7H11
Sali, vitamine,
cofattori, acido
oleico, albumina,
catalasi, glicerolo,
idrolizzato di caseina
Verde malachite,
cicloesimide,
lincomicina, acido
nalidixico
Carbenicillina,
amfotericina B,
polimixina B
Caratteristiche colturali
Caratteristiche delle colonie osservate
con un microscopio da dissezione
METODI COLTURALI
“ALTERNATIVI”
• metodo radiometrico
• terreno bifasico
• terreno con indicatore
fluorescente
• terreno Redox
METODO RADIOMETRICO
• flaconcini sigillati di terreno liquido
contenente un substrato (ac.
palmitico) marcato con 14C
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
contenimento delle contaminazioni
• liberazione di CO2 radiomarcata ad
opera del metabolismo batterico
• rilevamento di radioattività nella fase
gassosa come spia di batteri
metabolicamente attivi
notevole accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI
TERRENO BIFASICO
• flacone di terreno liquido per
micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per
il contenimento delle
contaminazioni
• slide con vari tipi di terreni solidi
(all'uovo, agarizzato, agar
cioccolato)
• arricchimento nel brodo e sviluppo
di colonie isolate sul terreno
moderato accorciamento dei tempi di crescita
solido
maggior sensibilità
TERRENO CON INDICATORE
FLUORESCENTE
• provetta di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
contenimento delle contaminazioni
• fluorocromo, incorporato in un film di silicone
sul fondo della provetta, sensibile alle
variazioni del contenuto di ossigeno
• comparsa di fluorescenza per effetto del
consumo di ossigeno operato dal metabolismo
batterico
• rilevamento della fluorescenza
– visivo, sotto una lampada UV
– automatizzato
accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
TERRENO REDOX
• i micobatteri crescono nel
terreno liquido di Kirchner
formando piccoli fiocchi o
intorbidamento uniforme
• i sali di tetrazolio presenti nel
terreno vengono ridotti a
formazano dai micobatteri in
crescita
• il formazano, rosa-violetto ed
insolubile, si fissa alla superficie
delle colonie micobatteriche
permettendone il riconoscimento
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
• accumulo di niacina
• riduzione dei nitrati
• catalasi
– quantitativa
– termoresistente
•
•
•
•
idrolisi del Tween 80
ureasi
arilsolfatasi
riduzione del tellurito
ANTIBIOGRAMMA
• i farmaci antitubercolari
maggiori
• il principio del metodo delle
proporzioni
• l’antibiogramma manuale
• l’antibiogramma automatizzato
• l’antibiogramma sui micobatteri
non tubercolari
ANTIBIOGRAMMA
L’Antibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in capsule di
Petri a quadranti contenenti agar 7H11
 Un quadrante è usato come controllo, mentre ciascuno
degli altri quadranti contiene un farmaco antimicrobico
diverso
 Tutti i quadranti vengono inoculati con una concentrazione
standardizzata del microrganismo in esame
 La sensibilità a ciascun farmaco è determinata
paragonando il numero delle colonie cresciute nei
quadranti contenenti i farmaci con il controllo (se la
percentuale di resistenza è superiore all’1% il ceppo viene
considerato resistente al farmaco)
ANTIBIOGRAMMA
Antibiotico incorporato
nell’agar
Antibiotico incorporato
in dischetti di carta
La diagnostica tradizionale
• Esame microscopico
– test rapido ma scarsamente sensibile
• Esame colturale
– sensibile ma richiede da una a otto settimane;
problema delle contaminazioni
• Identificazione
– test biochimico-colturali: scarsa specificità,
tempi lunghi
• Antibiogramma
– diretto: relativamente rapido ma con alta
incidenza di contaminazioni
– da ceppo isolato: tempi lunghi
Metodi di identificazione
“alternativi”
• DNA probe
• HPLC degli acidi micolici
• sequenziamento genico
16S rDNA
– SOD
– HSP65
–
DNA-probe, alternativa
all’identificazione?
• Vantaggi
– enorme risparmio di tempo
– specificità pressoché assoluta
• Svantaggi
– disponibili per un numero limitato di
specie
– costo
– complessità di esecuzione?
IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE
DNA-probes marcate con 125I
HPLC degli acidi micolici
• acidi grassi, ramificati in posizione 
• presenti nella parete batterica dei generi:
–
–
–
–
–
–
Corynebacterium: 22-38 atomi di C
Rhodococcus: 34-52 atomi di C
Nocardia: 44-60 atomi di C
Gordona: 48-66 atomi di C
Tsukamurella: 64-78 atomi di C
Mycobacterium: 60-90 atomi di C
• presenza di numerosi gruppi funzionali che
differenziano 7 tipi di acidi micolici
micobatterici
– alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega'
metossi-
HPLC degli acidi micolici
• saponificazione, estrazione e
derivatizzazione degli acidi micolici
presenti nella parete dei micobatteri
• frazionamento mediante HPLC
• individuazione dei picchi presenti nel
tracciato cromatografico e identificazione
per confronto con profili di riferimento
profilo HPLC del M. tuberculosis
complex
ad eccezione del M. bovis BCG
SI
esempi di profili HPLC
SI
SI
Il sequenziamento genico
• E’ la tecnica di riferimento per
l’identificazione
• Possibili bersagli
–
–
–
–
rRNA o rRNA 16S
gene codificante per le heat shock proteins
gene codificante per la superossido dismutasi
spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e
23S
Amplificazione genica
alternativa all’esame
microscopico?
• Vantaggi
– sensibilità superiore (ma non di molto)
– specificità di specie (ed eventualmente
anche di genere)
• Svantaggi
– esecuzione complessa
– costo elevato
Amplificazione genica
alternativa all’esame
colturale?
• Vantaggi
– molto più rapida
– se positiva rende superflua l’identificazione
– eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati
• Svantaggi
–
–
–
–
–
–
–
non altrettanto sensibile
non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie
false negatività dovute agli inibitori
false positività dovute a contaminazioni
costo elevato
esecuzione complessa
impossibilità di eseguire l’antibiogramma
Target dell’amplificazione
del M. tuberculosis complex
• Geni presenti in copia singola
– gene codificante per l’antigene di 65-kD (HSP)
• Brisson-Noel et al. Lancet 1989
– gene codificante per l’antigene di 126-kD (fusion
protein)
• Hermans et al. J.C.M. 1990
– gene codificante per lo rRNA 16S
• Boddinghaus et al. J.C.M. 1990
– gene codificante per l’antigene di 38-kD (proteina b)
• Miyazaki et al. J.C.M. 1993
• Sequenze ripetute
– IS6110
• Eisenach et al. J.I.D. 1990
Raccomandazioni sull’impiego del
test di amplificazione
• Non sostituisce esame microscopico e colturale
• Da eseguirsi solo su campioni selezionati
• L’attendibilità del test sui materiali non respiratori
non è dimostrata
• Non utilizzabile per il monitoraggio della terapia
• INTERPRETAZIONE:
– Amplificazione + / Microscopico + = probabile TBC
– Amplificazione - / Microscopico + :
ripetizione su altri 2 campioni, se il risultato viene
confermato
= infezione da MOTT o presenza di
inibitori
– Amplificazione + / Microscopico - :
ripetizione su uno o 2 campioni, se il risultato viene
confermato = probabile TBC
Conclusioni
• AMPLIFICAZIONE?
SI, ma ….
– solo in centri qualificati
– solo su campioni selezionati
– non per il monitoraggio della terapia
• La sensibilità dei sistemi commerciali
deve essere aumentata (ovviamente non
a scapito della specificità)
• Le tecniche in house non sono adatte
all’impiego in routine
Epidemiologia molecolare
• Sorveglianza della tubercolosi e
tracciamento di ceppi particolari
(Beijing)
• Riconoscimento delle infezioni miste
• Distinzione di recidive e reinfezioni
• Individuazione delle contaminazioni di
laboratorio
Principali tecniche per
l’epidemiologia molecolare
• PFGE
– frammentazione del genoma mediante enzimi di
restrizione specifici per siti poco frequenti
• PCR random
– usa primer scelti in maniera casuale
• RFLP
– applicabile a specie di cui si conoscono insertion
sequence
RFLP
• BERSAGLIO: il transposone IS1610, di cui possono
essere mediamente presenti nel M. tuberculosis complex
da 6 a 17 copie, variamente dislocate nel genoma
• PRINCIPIO: un enzima di restrizione, specifico per un
sito presente all’interno del IS1610, spezzetta il genoma
in un numero di frammenti non inferiore al numero di IS
presenti. I frammenti presentano dimensioni diverse a
seconda della posizione dei singoli IS nel genoma
• RIVELAZIONE: mediante elettroforesi si ottengono
pattern che differiscono per il numero e la posizione
delle bande
• La possibilità che ceppi diversi abbiano pattern uguali
sono trascurabili, la stabilità dei pattern è elevata
RFLP fingerprinting